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["無断転載を禁ずる　（国立医薬品食品衛生研究所）"]
["ref_ID","PMID","Animal/Plant\n動物/植物","Species\n種名","Techniques\n用いた技術","Target genes\n標的遺伝子","Journal\n雑誌名","Title\nタイトル","Year\n年","Vol/pages\n巻・号・ページ","Authors\n著者","Affiliations\n所属機関（国）","PMID","DOI","Abstract \n抄録 ","species2","Abstract (Jan)\n日本語抄録"]
[1,31832301,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","ovalbumin","3 Biotech","Efficient knock-in at the chicken ovalbumin locus using adenovirus as a CRISPR/Cas9 delivery system.",2019,"9(12):454","[Qin X et al.]","Guangxi University, Guangxi, China.",31832301,"10.1007/s13205-019-1966-3 ","In this study, efficient knock-in (KI) of human epidermal growth factor (hEGF) cDNA at the ovalbumin (OV) locus in cultured chicken cells was achieved using adenovirus as a delivery for CRISPR/Cas9 elements and optimizing donor vector construction. The strategy of recruiting donor DNA to the insertion site further  improved the KI efficiency. The inserted hEGF cDNA can expressed in primary oviduct cells and secreted hEGF promoted proliferation of Hela cells. Moreover, we achieved efficient KI in blastoderm cells without altering their induction in  vitro and obtained germline chimeric KI chicken embryos by transplanting KI blastoderm cells as well as injecting adenovirus directly, in vivo. Our results provided an efficient KI method for chicken cells and embryos, and lay the foundation for more convenient production of KI chicken at the OV locus, which will promote the development of oviduct-specific bioreactor.","chicken","この研究では、培養ニワトリ細胞の卵白アルブミン（OV）遺伝子座でのヒト上皮成長因子（hEGF）cDNAの効率的なノックイン（KI）が、CRISPR / Cas9エレメントの送達としてアデノウイルスを使用し、ドナーベクター構築を最適化することで達成されました。挿入部位にドナーDNAを補充する戦略は、KI効率をさらに改善しました。挿入されたhEGFcDNAは初代卵管細胞で発現し、分泌されたhEGFはHela細胞の増殖を促進します。さらに、in vitroでの誘導を変えることなく、胚盤葉細胞で効率的なKIを達成し、KI胚盤葉細胞を移植し、in vivoでアデノウイルスを直接注入することにより、生殖細胞系キメラKIニワトリ胚を取得しました。私たちの結果は、ニワトリの細胞と胚に効率的なKI法を提供し、卵管特異的バイオリアクターの開発を促進するOV遺伝子座でのKIニワトリのより便利な生産の基礎を築きました。"]
[2,31331641,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","HMG-box protein 1","Biochemical and biophysical research communications","Transcription factor HBP1: A regulator of senescence and apoptosis of preadipocytes.",2019,"517(2):216-220","[Chen H et al.]","Key Laboratory of Chicken Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Harbin, China.",31331641,"10.1016/j.bbrc.2019.07.048 ","BACKGROUND: /aim: HMG-box protein 1 (HBP1) plays an important role in the senescence and apoptosis of mammalian cells, but its role in chicken cells remains unclear. The aim of this study was to investigate the effects of HBP1 on  senescence and apoptosis of chicken preadipocytes. METHODS: The immortalized chicken preadipocyte cell line (ICP2) was used as a cell model. Chicken HBP1 knockout and overexpressing preadipocyte cell lines were established using CRISPR/Cas9 gene editing technology and lentiviral infection. Western blotting was used to detect the protein expression of HBP1 and senescence markers p16 and  p53. Cell senescence was measured by Sa-beta-Gal staining and apoptosis was detected by flow cytometry. RESULTS: HBP1 was highly expressed in senescent ICP2  cells compared with young ICP2 cells. After the deletion of HBP1, the degree of senescence, the apoptosis rate and the protein expression levels of p16 and p53 were significantly reduced. After the overexpression of HBP1, the degree of senescence, the apoptosis rate and the protein expression levels of p16 and p53 were significantly increased. CONCLUSION: HBP1 promotes the senescence and apoptosis of chicken preadipocytes.","chicken","背景：/ aim：HMG-box protein 1（HBP1）は哺乳類細胞の老化とアポトーシスに重要な役割を果たしていますが、ニワトリ細胞におけるその役割は不明なままです。この研究の目的は、ニワトリ前脂肪細胞の老化とアポトーシスに対するHBP1の影響を調査することでした。方法：不死化したニワトリ前脂肪細胞株（ICP2）を細胞モデルとして使用した。ニワトリHBP1ノックアウトおよび過剰発現前脂肪細胞株は、CRISPR / Cas9遺伝子編集技術とレンチウイルス感染を使用して確立されました。ウエスタンブロッティングを使用して、HBP1および老化マーカーp16およびp53のタンパク質発現を検出しました。細胞老化はSa-beta-Gal染色によって測定され、アポトーシスはフローサイトメトリーによって検出されました。結果：HBP1は、若いICP2細胞と比較して老化したICP2細胞で高度に発現していました。HBP1の削除後、老化の程度、アポトーシス率、およびp16とp53のタンパク質発現レベルが大幅に低下しました。HBP1の過剰発現後、老化の程度、アポトーシス率、およびp16とp53のタンパク質発現レベルが大幅に増加しました。結論：HBP1はニワトリ前脂肪細胞の老化とアポトーシスを促進します。"]
[3,30951374,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","exogenous genes of donor plasmids into Z chromosomes","FASEB journal","Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development.",2019,"33(7):8519-8529","[Lee HJ et al.]","Seoul National University, Seoul, South Korea.",30951374,"10.1096/fj.201802671R ","Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein 9 (Cas9) have facilitated the production of genome-edited animals for use as models. Because of their unique developmental system, avian species offer many advantages as model vertebrates. Here, we report the development of novel chicken models using the CRISPR/Cas9-mediated nonhomologous end joining repair pathway in chicken primordial germ cells (PGCs). Through the introduction of a donor plasmid containing short guide RNA recognition sequences and CRISPR/Cas9 plasmids into chicken PGCs, exogenous genes of donor plasmids were precisely inserted into target loci, and production of transgenic chickens was accomplished through subsequent transplantation of the Z  chromosome-targeted PGCs. Using this method, we successfully accomplished the targeted gene insertion to the chicken sex Z chromosome without detected off-target effects. The genome-modified chickens robustly expressed green fluorescent protein from the Z chromosome, which could then be used for easy sex  identification during embryogenesis. Our results suggest that this powerful genome-editing method could be used to develop many chicken models and should significantly expand the application of genome-modified avians.-Lee, H. J., Yoon, J. W., Jung, K. M., Kim, Y. M., Park, J. S., Lee, K. Y., Park, K. J., Hwang, Y. S., Park, Y. H., Rengaraj, D., Han, J. Y. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development.","chicken","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）とCRISPR関連タンパク質9（Cas9）は、モデルとして使用するためのゲノム編集動物の生産を容易にしました。それらの独特の発達システムのために、鳥類はモデル脊椎動物として多くの利点を提供します。ここでは、CRISPR / Cas9を介したニワトリ始原生殖細胞（PGC）の修復経路に参加する非相同末端を使用した新規ニワトリモデルの開発について報告します。ショートガイドRNA認識配列とCRISPR / Cas9プラスミドを含むドナープラスミドをニワトリPGCに導入することにより、ドナープラスミドの外因性遺伝子を標的遺伝子座に正確に挿入し、その後のZ染色体標的移植によりトランスジェニックニワトリの生産を達成しました。 PGC。この方法を使用して、オフターゲット効果を検出することなく、ニワトリの性別Z染色体へのターゲット遺伝子の挿入を成功裏に達成しました。ゲノム修飾されたニワトリは、Z染色体から緑色蛍光タンパク質を強力に発現しました。これは、胚発生時の性別の識別に使用できます。私たちの結果は、この強力なゲノム編集方法が多くのニワトリモデルの開発に使用でき、ゲノム改変鳥類のアプリケーションを大幅に拡大するはずであることを示唆しています-Lee、HJ、Yoon、JW、Jung、KM、Kim、YM、Park、JS 、Lee、KY、Park、KJ、Hwang、YS、Park、YH、Rengaraj、D.、Han、JY鳥類の性別モデル開発のためのニワトリ始原生殖細胞のZ染色体への標的遺伝子挿入。"]
[4,30085885,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","G0/G1 switch gene 2 (g0s2)","FASEB journal","Disruption of G0/G1 switch gene 2 ( G0S2) reduced abdominal fat deposition and altered fatty acid composition in chicken.",2019,"33(1):1188-1198","[Park TS et al.]","Seoul National University, Pyeongchang-gun, Gangwon-do, Korea.",30085885,"10.1096/fj.201800784R ","Chicken as a food source is one of the most widespread domestic animals, and it has been used extensively as a research model. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system is the most efficient and reliable tool for precise genome-targeted modification and has generated considerable excitement for industrial applications, as well as biologic science. Unlike in mammals, germline-transmittable primordial germ cells (PGCs) in chicken were used as an alternative strategy for the production of genetically altered chickens. Here, by combining the CRISPR-Cas9 platform and germ cell-mediated germline transmission,  we generated G0/G1 switch gene 2 ( G0S2) knockout (KO) chickens, and G0S2 null KO chickens showed a dramatic reduction of abdominal fat deposition without affecting other economic traits. Additionally, G0S2 null KO chickens had altered  fatty acid compositions in their blood and abdominal fat compared with wild-type  chickens under normal dietary conditions. The global mRNA sequencing data showed  that G0S2 disruption in chickens would activate the adipose tissue-specific peroxisomal oxidation pathway, and enoyl-coenzyme A (CoA), hydratase/3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase might be a target molecule in metabolic homeostasis in the chicken adipose tissue. Our results demonstrate that the CRISPR-Cas9 system with chicken PGCs can facilitate the production of specific genome-edited chickens for practical applications, as well as basic research.-Park, T. S., Park, J., Lee, J. H., Park, J.-W., Park, B.-C. Disruption  of G0/G1 switch gene 2 ( G0S2) reduced abdominal fat deposition and altered fatty acid composition in chicken.","chicken","食料源としてのニワトリは、最も普及している家畜の1つであり、研究モデルとして広く使用されています。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）-CRISPR関連タンパク質9（Cas9）システムは、正確なゲノム標的修飾のための最も効率的で信頼性の高いツールであり、産業用途や生物科学にかなりの興奮をもたらしています。哺乳類とは異なり、ニワトリの生殖細胞系列伝達可能な始原生殖細胞（PGC）は、遺伝的に改変されたニワトリの生産のための代替戦略として使用されました。ここでは、CRISPR-Cas9プラットフォームと生殖細胞を介した生殖細胞系伝達を組み合わせることにより、G0 / G1スイッチ遺伝子2（G0S2）ノックアウト（KO）ニワトリを生成し、G0S2 nullKOニワトリは他に影響を与えることなく腹部脂肪沈着の劇的な減少を示しました経済的特徴。さらに、G0S2 null KOニワトリは、通常の食餌条件下で野生型ニワトリと比較して、血液および腹部脂肪の脂肪酸組成が変化していました。グローバルmRNAシーケンスデータは、ニワトリのG0S2破壊が脂肪組織特異的なペルオキシソーム酸化経路を活性化し、エノイル補酵素A（CoA）、ヒドラターゼ/ 3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼがニワトリ脂肪の代謝恒常性の標的分子である可能性があることを示しました組織。私たちの結果は、ニワトリPGCを備えたCRISPR-Cas9システムが、基礎研究だけでなく、実用的なアプリケーションのための特定のゲノム編集ニワトリの生産を容易にすることができることを示しています-Park、TS、Park、J.、Lee、JH、Park、J。 -W。、朴智星、B.-C。G0 / G1スイッチ遺伝子2（G0S2）の破壊は、鶏の腹部脂肪沈着を減少させ、脂肪酸組成を変化させました。"]
[5,31998323,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","CXCR4","Frontiers in immunology","Blocking of the CXCR4-CXCL12 Interaction Inhibits the Migration of Chicken B Cells Into the Bursa of Fabricius.",2019,"10:3057","[Laparidou M et al.]","Reproductive Biotechnology, School of Life Sciences Weihenstephan, Technical University of Munich, Freising, Germany.",31998323,"10.3389/fimmu.2019.03057 ","B cells have first been described in chickens as antibody producing cells and were named after the Bursa of Fabricius, a unique organ supporting their development. Understanding different factors mediating the early migration of B cells into the bursa of Fabricius is crucial for the study of B cell biology. While CXCL12 (stromal derived factor 1) was found to play an important role in B  lymphocyte trafficking in mammals, its role in the chicken is still unknown. Previous studies indicated that chicken CXCL12 and its receptor CXCR4 are simultaneously expressed during bursal development. In this study, we investigated whether the CXCR4/CXCL12 interaction mediates B cell migration in chicken embryo. We used the CRISPR/Cas9 system to induce a CXCR4 knockout in chicken B cells which led to chemotaxis inhibition toward CXCL12. This was confirmed by adoptive cell transfer and inhibition of the CXCR4/CXCL12 interaction by blocking with the small inhibitor AMD3100. In addition, we found that the chicken exhibits similarities to mice when it comes to CXCR4 being dependent on B cell receptor expression. B cells lacking the B cell receptor failed to migrate toward CXCL12 and showed no response upon CXCL12 stimulation. Overall, we demonstrated the significance of CXCR4/CXCL12 in chicken B cell development in vivo and the importance of the B cell receptor in CXCR4 dependent  signaling.","chicken","B細胞は、ニワトリで抗体産生細胞として最初に説明され、その発達をサポートするユニークな器官であるファブリキウス嚢にちなんで名付けられました。B細胞のファブリキウス嚢への早期移動を媒介するさまざまな要因を理解することは、B細胞生物学の研究にとって非常に重要です。CXCL12（間質由来因子1）は、哺乳類のBリンパ球輸送に重要な役割を果たすことがわかっていますが、ニワトリにおけるその役割はまだわかっていません。以前の研究では、ニワトリのCXCL12とその受容体CXCR4は、嚢の発達中に同時に発現することが示されていました。この研究では、CXCR4 / CXCL12相互作用がニワトリ胚のB細胞遊走を媒介するかどうかを調査しました。CRISPR / Cas9システムを使用して、ニワトリB細胞でCXCR4ノックアウトを誘発し、CXCL12に対する走化性阻害を引き起こしました。これは、養子細胞移植と、小さな阻害剤AMD3100でブロックすることによるCXCR4 / CXCL12相互作用の阻害によって確認されました。さらに、CXCR4がB細胞受容体の発現に依存していることに関しては、ニワトリがマウスと類似していることを発見しました。B細胞受容体を欠くB細胞はCXCL12に向かって移動できず、CXCL12刺激に対して応答を示さなかった。全体として、invivoでのニワトリB細胞の発達におけるCXCR4 / CXCL12の重要性と、CXCR4依存性シグナル伝達におけるB細胞受容体の重要性を示しました。"]
[6,31736964,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","methyl binding domain protein 4 (mbd4)","Frontiers in immunology","Chicken MBD4 Regulates Immunoglobulin Diversification by Somatic Hypermutation.",2019,"10:2540","[Costello R et al.]","University of Illinois at Chicago, Chicago, IL, USA.",31736964,"10.3389/fimmu.2019.02540 ","Immunoglobulin (Ig) diversification occurs via somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR), and is initiated by activation-induced deaminase (AID), which converts cytosine to uracil. Variable (V) region genes undergo SHM to create amino acid substitutions that produce antibodies with higher affinity for antigen. The conversion of cytosine to uracil in DNA promotes mutagenesis. Two distinct DNA repair mechanisms regulate uracil processing in Ig  genes. The first involves base removal by the uracil DNA glycosylase (UNG), and the second detects uracil via the mismatch repair (MMR) complex. Methyl binding domain protein 4 (MBD4) is a uracil glycosylase and an intriguing candidate for involvement in somatic hypermutation because of its interaction with the MMR MutL homolog 1 (MLH1). We found that the DNA uracil glycosylase domain of MBD4 is highly conserved among mammals, birds, shark, and insects. Conservation of the human and chicken MBD4 uracil glycosylase domain structure is striking. Here we examined the function of MBD4 in chicken DT40 B cells which undergo constitutive  SHM. We constructed structural variants of MBD4 DT40 cells using CRISPR/Cas9 genome editing. Disruption of the MBD4 uracil glycosylase catalytic region increased SHM frequency in IgM loss assays. We propose that MBD4 plays a role in  SHM.","chicken","免疫グロブリン（Ig）の多様化は、体細胞超変異（SHM）およびクラススイッチ組換え（CSR）を介して発生し、シトシンをウラシルに変換する活性化誘導デアミナーゼ（AID）によって開始されます。可変（V）領域遺伝子は、SHMを受けて、抗原に対してより高い親和性を持つ抗体を生成するアミノ酸置換を作成します。DNAにおけるシトシンのウラシルへの変換は突然変異誘発を促進します。2つの異なるDNA修復メカニズムが、Ig遺伝子のウラシルプロセシングを調節します。1つ目は、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UNG）による塩基除去を含み、2つ目は、ミスマッチ修復（MMR）複合体を介してウラシルを検出します。メチル結合ドメインタンパク質4（MBD4）は、ウラシルグリコシラーゼであり、MMR MutLホモログ1（MLH1）との相互作用により、体細胞超変異に関与する興味深い候補です。MBD4のDNAウラシルグリコシラーゼドメインは、哺乳類、鳥類、サメ、昆虫の間で高度に保存されていることがわかりました。ヒトとニワトリのMBD4ウラシルグリコシラーゼドメイン構造の保存は目を見張るものがあります。ここでは、構成的SHMを受けるニワトリDT40B細胞におけるMBD4の機能を調べました。CRISPR / Cas9ゲノム編集を使用してMBD4DT40細胞の構造変異体を構築しました。MBD4ウラシルグリコシラーゼ触媒領域の破壊は、IgM損失アッセイでSHM頻度を増加させました。MBD4がSHMで役割を果たすことを提案します。"]
[7,31025250,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","Atg5","In vitro cellular & developmental biology. Animal","Knockout of Atg5 inhibits proliferation and promotes apoptosis of DF-1 cells.",2019,"55(5):341-348","[Liao Z et al.]","South China Agricultural University, Guangzhou, China.",31025250,"10.1007/s11626-019-00342-7 ","Atg5, as a switch of cell autophagy and apoptosis, plays an important regulatory  role in the occurrence and development of autophagy. Atg5 has been reported to involve the autophagy process but little in the apoptotic process. Here, we constructed an Atg5(-/-) DF-1 cell line using the CRISPR/Cas9 assay and confirmed the significant difference in growth kinetics between Atg5(-/-) DF-1 cells and wild-type DF-1 cells. Importantly, we found that Atg5 suppresses the cellular proliferation and induce the apoptosis in DF-1 cells by Hoechst's staining, flow  cytometry, and caspase activity assay. All these findings indicated that Atg5 plays an important role in the proliferation of DF-1 cells. On the other hand, we compared the expression of autophagy key proteins LC3 and P62 in Atg5 knockout cells and wild-type cells, and detected the aggregation point distribution of LC3 protein in cells by laser confocal technique; our results showed that Atg5 knockout inhibited autophagy compared with wild-type cells. The present findings  further help to resolve the molecular mechanisms regulating Atg5 autophagy and apoptosis.","chicken","Atg5は、細胞のオートファジーとアポトーシスのスイッチとして、オートファジーの発生と発達において重要な調節的役割を果たしています。Atg5はオートファジープロセスに関与していると報告されていますが、アポトーシスプロセスにはほとんど関与していません。ここでは、CRISPR / Cas9アッセイを使用してAtg5（-/-）DF-1細胞株を構築し、Atg5（-/-）DF-1細胞と野生型DF-1細胞の間の増殖動態の有意差を確認しました。重要なことに、Hoechstの染色、フローサイトメトリー、およびカスパーゼ活性アッセイにより、Atg5が細胞増殖を抑制し、DF-1細胞のアポトーシスを誘導することを発見しました。これらすべての発見は、Atg5がDF-1細胞の増殖に重要な役割を果たしていることを示しています。一方、Atg5ノックアウト細胞と野生型細胞におけるオートファジーキータンパク質LC3とP62の発現を比較し、レーザー共焦点技術によって細胞内のLC3タンパク質の凝集点分布を検出しました。私たちの結果は、Atg5ノックアウトが野生型細胞と比較してオートファジーを阻害することを示しました。現在の調査結果はさらにAtg5オートファジーとアポトーシスを調節する分子メカニズムを解決するのに役立ちます。"]
[8,30976416,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","ALV subgroup A (tva)","Journal of animal science and biotechnology","Sequential disruption of ALV host receptor genes reveals no sharing of receptors  between ALV subgroups A, B, and J.",2019,"10:23","[Lee HJ et al.]","Seoul National University, Seoul, Korea.",30976416,"10.1186/s40104-019-0333-x ","Background: Previously, we showed that targeted disruption of viral receptor genes in avian leukosis virus (ALV) subgroups using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9))-based genome editing confers resistance to ALV subgroups B and J. Here, we used the same strategy to target the receptor expressed by ALV subgroup A (TVA) and generate chicken cells resistant to infection by this virus. Results: CRISPR/Cas9-based disruption of exon 2 within the tva gene of DF-1 fibroblasts conferred resistance to infection by ALV subgroup A regardless of whether frameshift mutations were introduced during editing. Conversely, overexpression of the wild-type TVA receptor (wtTVA) by tva-modified DF-1 clones restored susceptibility to ALV subgroup A. The results confirm that exon 2, which contains the low-density lipoprotein receptor class A domain of TVA, is critical for virus entry. Furthermore, we sequentially modified DF-1 cells by editing the tva, tvb,  and Na(+)/H(+) exchange 1 (chNHE1) genes, which are the specific receptors for ALV subgroups A, B, and J, respectively. Conclusions: Simultaneous editing of multiple receptors to block infection by different subgroups of ALV confirmed that ALV subgroups A, B, and J do not share host receptors. This strategy could be used to generate cells resistant to multiple viral pathogens that use distinct receptors for cell entry.","chicken","背景：以前は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9））ベースのゲノム編集を使用した鳥類白血病ウイルス（ALV）サブグループのウイルス受容体遺伝子の標的破壊がALVサブグループへの耐性を与えることを示しましたBとJ。ここでは、同じ戦略を使用して、ALVサブグループA（TVA）によって発現される受容体を標的とし、このウイルスによる感染に耐性のあるニワトリ細胞を生成しました。結果：DF-1線維芽細胞のtva遺伝子内のエクソン2のCRISPR / Cas9ベースの破壊は、編集中にフレームシフト変異が導入されたかどうかに関係なく、ALVサブグループAによる感染に対する耐性を付与しました。逆に、tva修飾DF-1クローンによる野生型TVA受容体（wtTVA）の過剰発現は、ALVサブグループAに対する感受性を回復しました。結果は、TVAの低密度リポタンパク質受容体クラスAドメインを含むエキソン2がウイルスの侵入に不可欠です。さらに、ALVサブグループA、B、およびJの特定の受容体であるtva、tvb、およびNa（+）/ H（+）交換1（chNHE1）遺伝子を編集することにより、DF-1細胞を順次変更しました。結論：ALVの異なるサブグループによる感染をブロックするための複数の受容体の同時編集により、ALVサブグループA、B、およびJが宿主受容体を共有しないことが確認されました。この戦略は、細胞侵入に異なる受容体を使用する複数のウイルス性病原体に耐性のある細胞を生成するために使用できます。"]
[9,31832093,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","dazl; pou5f3; ovalbumin","Journal of biological engineering","HMEJ-mediated efficient site-specific gene integration in chicken cells.",2019,"13:90","[Xie L et al.]","Guangxi University, Nanning, Guangxi, China.",31832093,"10.1186/s13036-019-0217-9 ","Background: The production of transgenic chicken cells holds great promise for several diverse areas, including developmental biology and biomedical research. To this end, site-specific gene integration has been an attractive strategy for generating transgenic chicken cell lines and has been successfully adopted for inserting desired genes and regulating specific gene expression patterns. However, optimization of this method is essential for improving the efficiency of genome modification in this species. Results: Here we compare gene knock-in methods based on homology-independent targeted integration (HITI), homology-directed repair (HDR) and homology mediated end joining (HMEJ) coupled with a clustered regularly interspaced short palindromic repeat associated protein 9 (CRISPR/Cas9) gene editing system in chicken DF-1 cells and primordial  germ cells (PGCs). HMEJ was found to be a robust and efficient method for gene knock-in in chicken PGCs. Using this method, we successfully labeled the germ cell specific gene DAZL and the pluripotency-related gene Pou5f3 in chicken PGCs  through the insertion of a fluorescent protein in the frame at the 3' end of the  gene, allowing us to track cell migration in the embryonic gonad. HMEJ strategy was also successfully used in Ovalbumin, which accounts for more than 60% of proteins in chicken eggs, suggested its good promise for the mass production of protein with pharmaceutical importance using the chicken oviduct system. Conclusions: Taken together, these results demonstrate that HMEJ efficiently mediates site-specific gene integration in chicken PGCs, which holds great potential for the biopharmaceutical engineering of chicken cells.","chicken","背景：トランスジェニックニワトリ細胞の生産は、発生生物学や生物医学研究など、いくつかの多様な分野で大きな期待が寄せられています。この目的のために、部位特異的遺伝子統合は、トランスジェニックニワトリ細胞株を生成するための魅力的な戦略であり、所望の遺伝子を挿入し、特定の遺伝子発現パターンを調節するために首尾よく採用されてきた。ただし、この方法の最適化は、この種のゲノム修飾の効率を向上させるために不可欠です。結果：ここでは、相同性に依存しない標的統合（HITI）、相同性指向修復（HDR）、およびクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復関連タンパク質9（CRISPR）と組み合わせた相同性媒介末端結合（HMEJ）に基づく遺伝子ノックイン法を比較します。 / Cas9）ニワトリDF-1細胞および始原生殖細胞（PGC）の遺伝子編集システム。HMEJは、ニワトリPGCにおける遺伝子ノックインのための堅牢で効率的な方法であることがわかりました。この方法を使用して、遺伝子の3 '末端のフレームに蛍光タンパク質を挿入することにより、ニワトリPGCの生殖細胞特異的遺伝子DAZLと多能性関連遺伝子Pou5f3の標識に成功し、細胞移動を追跡できるようになりました。胚性腺。HMEJ戦略は、鶏卵のタンパク質の60％以上を占めるオーバルブミンでもうまく使用されており、鶏卵管システムを使用した製薬上重要なタンパク質の大量生産に有望であることが示唆されました。結論：まとめると、これらの結果は、HMEJがニワトリPGCにおける部位特異的遺伝子統合を効率的に媒介することを示しています。これは、ニワトリ細胞のバイオ医薬品工学に大きな可能性を秘めています。"]
[10,31594694,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","ovalbumin","Journal of bioscience and bioengineering","Targeted knock-in into the OVA locus of chicken cells using CRISPR/Cas9 system with homology-independent targeted integration.",2019,null,"[Shi M et al.]","Kyushu University, Fukuoka, Japan.",31594694,"10.1016/j.jbiosc.2019.09.011 ","It is anticipated that transgenic avian species will be used as living bioreactors for the production of biopharmaceutical proteins. Precise tissue-specific expression of exogenous genes is a major challenge for the development of avian bioreactors. No robust vector is currently available for highly efficient and specific expression. In recent years, genome-editing techniques such as the CRISPR/Cas9 system have emerged as efficient and user-friendly genetic modification tools. Here, to apply the CRISPR/Cas9 system for the development of transgenic chickens, guide RNA sequences (gRNAs) of the CRISPR/Cas9 system for the ovalbumin (OVA) locus were evaluated for the oviduct-specific expression of exogenous genes. An EGFP gene expression cassette  was introduced into the OVA locus of chicken DF-1 and embryonic fibroblasts using the CRISPR/Cas9 system mediated by homology-independent targeted integration. For the knock-in cells, EGFP expression was successfully induced by activation of the endogenous OVA promoter using the dCas9-VPR transactivation system. The combination of gRNAs designed around the OVA TATA box was important to induce endogenous OVA gene expression with high efficiency. These methods provide a useful tool for studies on the creation of transgenic chicken bioreactors and the activation of tissue-specific promoters.","chicken","トランスジェニック鳥類は、バイオ医薬品タンパク質の生産のための生きたバイオリアクターとして使用されることが予想されます。外因性遺伝子の正確な組織特異的発現は、鳥類のバイオリアクターの開発にとって大きな課題です。現在、非常に効率的で特異的な発現に利用できる堅牢なベクターはありません。近年、CRISPR / Cas9システムなどのゲノム編集技術が効率的でユーザーフレンドリーな遺伝子改変ツールとして登場しました。ここでは、トランスジェニックニワトリの開発にCRISPR / Cas9システムを適用するために、オボアルブミン（OVA）遺伝子座のCRISPR / Cas9システムのガイドRNA配列（gRNA）を、外因性遺伝子の卵管特異的発現について評価しました。EGFP遺伝子発現カセットは、相同性に依存しない標的統合によって媒介されるCRISPR / Cas9システムを使用して、ニワトリDF-1および胚性線維芽細胞のOVA遺伝子座に導入されました。ノックイン細胞の場合、dCas9-VPRトランス活性化システムを使用した内因性OVAプロモーターの活性化により、EGFP発現が正常に誘導されました。OVA TATAボックスを中心に設計されたgRNAの組み合わせは、内因性OVA遺伝子の発現を高効率で誘導するために重要でした。これらの方法は、トランスジェニックニワトリバイオリアクターの作成と組織特異的プロモーターの活性化に関する研究に役立つツールを提供します。"]
[11,30806053,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","EAV-EP genome","Sheng wu gong cheng xue bao = Chinese journal of biotechnology","[CRISPR/Cas9-mediated foreign gene targeted knock-in into the chicken EAV-HP genome].",2019,"35(2):236-243","[Guo M et al.]","Shaanxi University of Technology, Hanzhong, Shaanxi, China.",30806053,"10.13345/j.cjb.180224 ","The study aims to use CRISPR/Cas9 introducing foreign gene targeted knock-in into chicken EAV-HP genome. First, specific primers were designed for amplification of EAV-HP left, right homologous arms and enhanced green fluorescent protein (eGFP)  expression cassette. PCR products of homologous arms were ligated to both sides of eGFP by overlap extension PCR, resulting in full-length donor DNA fragment designated as LER. Then LER fragments were cloned into pMD19-T to obtain donor vector pMDT-LER. Subsequently, the donor vector pMDT-LER was transfected into HEK293T cells to verify the expression of eGFP gene. Furthermore, co-transfection of CRISPR/Cas9 expression vector and pMDT-LER into chicken DF-1 cells was performed to achieve eGFP transgenic cells. Meanwhile, eGFP expression was observed in cells, and the event of eGFP integration into EAV-HP genome was detectable by amplification of target DNA. Finally, the transgenic DF-1 cells were passaged seven times, and the stable integration and expression of eGFP was  checked by PCR and Western blotting. These results demonstrated that eGFP gene was knocked into the EAV-HP genome successfully, which provides a new integration site for research of transgenic chicken.","chicken","この研究は、外来遺伝子を標的としたノックインをニワトリEAV-HPゲノムに導入するCRISPR / Cas9を使用することを目的としています。最初に、EAV-HPの左、右の相同アームおよび強化緑色蛍光タンパク質（eGFP）発現カセットの増幅用に特定のプライマーを設計しました。相同アームのPCR産物をオーバーラップエクステンションPCRによってeGFPの両側にライゲーションし、LERと呼ばれる完全長のドナーDNAフラグメントを生成しました。次に、LERフラグメントをpMD19-Tにクローン化して、ドナーベクターpMDT-LERを得た。続いて、ドナーベクターpMDT-LERをHEK293T細胞にトランスフェクトして、eGFP遺伝子の発現を確認しました。さらに、CRISPR / Cas9発現ベクターとpMDT-LERのニワトリDF-1細胞への同時トランスフェクションを実施して、eGFPトランスジェニック細胞を実現しました。一方、eGFPの発現は細胞内で観察され、EAV-HPゲノムへのeGFPの組み込みのイベントは、ターゲットDNAの増幅によって検出可能でした。最後に、トランスジェニックDF-1細胞を7回継代し、eGFPの安定した組み込みと発現をPCRとウエスタンブロッティングで確認しました。これらの結果は、eGFP遺伝子がEAV-HPゲノムに正常にノックインされたことを示しており、トランスジェニックニワトリの研究に新しい統合サイトを提供します。"]
[12,31240617,"animal","chicken","CRISPR;Cas9;","activation-induced cytidine deaminase","Virologica Sinica","A Novel DT40 Antibody Library for the Generation of Monoclonal Antibodies.",2019,"34(6):641-647","[Wang B et al.]","Institute of Pathogen Biology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing, China.",31240617,"10.1007/s12250-019-00142-z ","Early etiological diagnosis is very important for the control of sudden viral infections, and requires antibodies with both high sensitivity and high specificity. Traditional antibody preparation methods have limitations, such as a long and arduous cycle, complicated operation, and high expenses. A chicken lymphoma cell line, DT40, is known to produce IgM-type antibodies and undergo gene conversion and somatic mutation in the variable region of the immunoglobulin gene during culture. Here, the DT40 cell line was developed to produce antibody libraries and prepare antibody rapidly in vitro. Since hypermutation in DT40 cells was regulated by the activation-induced cytidine deaminase (AID) gene, AID  expression needs to be controlled to either fix the Ig sequence by stopping mutation or improve affinity by resuming mutation after the antibodies have been  selected. In this study, we generated a novel AID-inducible DT40 cell line (DT40-H7), in which the endogenous AID gene was knocked out using the CRISPR/Cas9 genome editing system, and an inducible AID gene, based on the Tet-Off expression system, was stably transfected. AID expression was controlled in DT40-H7 cells in a simple and efficient manner; gene conversion and point mutations were observed  only when AID was expressed. Using the antibody library generated from this cell  line, we successfully obtained monoclonal antibodies against the NS1 protein of Zika virus. The DT40-H7 cell line represents a useful tool for the selection and  evolution of antibodies and may also be a powerful tool for the rapid selection and generation of diagnostic antibodies for emerging infectious diseases.","chicken","早期の病因診断は、突然のウイルス感染の制御にとって非常に重要であり、高感度と高特異性の両方を備えた抗体を必要とします。従来の抗体調製法には、長くて骨の折れるサイクル、複雑な操作、高額な費用などの制限があります。ニワトリリンパ腫細胞株DT40は、IgM型抗体を産生し、培養中に免疫グロブリン遺伝子の可変領域で遺伝子変換と体細胞変異を起こすことが知られています。ここでは、DT40細胞株は、抗体ライブラリーを作成し、invitroで抗体を迅速に調製するために開発されました。DT40細胞の超変異は、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）遺伝子によって制御されているため、抗体を選択した後、変異を停止してIg配列を固定するか、変異を再開して親和性を向上させるために、AIDの発現を制御する必要があります。この研究では、CRISPR / Cas9ゲノム編集システムを使用して内因性AID遺伝子をノックアウトした新規AID誘導性DT40細胞株（DT40-H7）と、Tet-Offに基づく誘導性AID遺伝子を生成しました。発現系は安定してトランスフェクトされました。AIDの発現は、DT40-H7細胞で簡単かつ効率的に制御されました。遺伝子変換と点突然変異は、AIDが発現した場合にのみ観察されました。この細胞株から生成された抗体ライブラリーを使用して、ジカウイルスのNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体を取得することに成功しました。DT40-H7細胞株は、抗体の選択と進化のための有用なツールであり、新興感染症の診断抗体の迅速な選択と生成のための強力なツールでもあります。"]
[13,31297696,"animal","cow","CRISPR;Cas9;","MSTN","In vitro cellular & developmental biology. Animal","Genome mutation after the introduction of the gene editing by electroporation of  Cas9 protein (GEEP) system into bovine putative zygotes.",2019,"55(8):598-603","[Namula Z et al.]","Guangdong Ocean University, Zhanjiang, China.",31297696,"10.1007/s11626-019-00385-w ","The present study was designed to investigate the effects of voltage strength on  embryonic developmental rate and mutation efficiency in bovine putative zygotes during electroporation with the CRISPR/Cas9 system to target the MSTN gene at different time points after insemination. Results showed that there was no significant interaction between electroporation time and voltage strength on the  embryonic cleavage and blastocyst formation rates. However, increasing the voltage strength to 20 V/mm to electroporate the zygotes at 10 h after the start  of insemination yielded significantly lower blastocyst formation rates (P < 0.05) than those of the 10-V/mm electroporated zygotes. Mutation efficiency was then assessed in individual blastocysts by DNA sequence analysis of the target sites in the MSTN gene. A positive correlation between mutation rate and voltage strength was observed. The mutation efficiency in mutant blastocysts was significantly higher in the zygotes electroporated with 20 V/mm at 10 h after the start of insemination (P < 0.05) than in the zygotes electroporated at 15 h, irrespective of the voltage strength. We also noted that a certain number of blastocysts from zygotes that were electroporated with more than 15 V/mm at 10 h  (4.8-16.7%) and 20 V/mm at 15 h (4.8%) were biallelic mutants. Our results suggest that the voltage strength during electroporation as well as electroporation time certainly have effects on the embryonic developmental rate and mutation efficiency in bovine putative zygotes.","cow","本研究は、CRISPR / Cas9システムを用いたエレクトロポレーション中のウシの推定接合子における胚発生率および突然変異効率に対する電圧強度の影響を調査し、授精後のさまざまな時点でMSTN遺伝子を標的とするように設計されました。結果は、エレクトロポレーション時間と胚の卵割および胚盤胞形成率の電圧強度との間に有意な相互作用がないことを示した。ただし、授精開始後10時間で接合子をエレクトロポレーションするために電圧強度を20 V / mmに上げると、10 V / mmのエレクトロポレーションした接合子よりも有意に低い胚盤胞形成率（P <0.05）が得られました。次に、MSTN遺伝子の標的部位のDNA配列分析により、個々の胚盤胞の突然変異効率を評価しました。突然変異率と電圧強度の間に正の相関が観察されました。突然変異胚盤胞の突然変異効率は、電圧強度に関係なく、授精開始後10時間で20 V / mmでエレクトロポレーションした接合子の方が15時間でエレクトロポレーションした接合子よりも有意に高かった（P <0.05）。また、10時間で15 V / mm（4.8-16.7％）および15時間で20 V / mm（4.8％）を超えるエレクトロポレーションを行った接合子からの特定の数の胚盤胞が2対立遺伝子変異体であることに注目しました。我々の結果は、エレクトロポレーション中の電圧強度ならびにエレクトロポレーション時間は、ウシの推定接合子における胚発生速度および突然変異効率に確かに影響を与えることを示唆している。"]
[14,30845180,"animal","cow","CRISPR;Cas9;","mitochondrial transcription factor A (TFAM)","PloS one","Edition of TFAM gene by CRISPR/Cas9 technology in bovine model.",2019,"14(3):e0213376","[de Oliveira VC et al.]","University of Sao Paulo, Pirassununga, Sao Paulo, Brazil.",30845180,"10.1371/journal.pone.0213376 ","The mitochondrial transcription factor A (TFAM) is a mitochondrial DNA (mtDNA) binding protein essential for the initiation of transcription and genome maintenance. Recently it was demonstrated that the primary role of TFAM is to maintain the integrity of mtDNA and that it is a key regulator of mtDNA copy number. It was also shown that TFAM plays a central role in the mtDNA stress-mediated inflammatory response. In our study, we proposed to evaluate the  possibility of editing the TFAM gene by CRISPR/Cas9 technology in bovine fibroblasts, as TFAM regulates the replication specificity of mtDNA. We further attempted to maintain these cells in culture post edition in a medium supplemented with uridine and pyruvate to mimic Rho zero cells that are capable of surviving without mtDNA, because it is known that the TFAM gene is lethal in knockout mice and chicken. Moreover, we evaluated the effects of TFAM modification on mtDNA copy number. The CRISPR gRNA was designed to target exon 1  of the bovine TFAM gene and subsequently cloned. Fibroblasts were transfected with Cas9 and control plasmids. After 24 h of transfection, cells were analyzed by flow cytometry to evaluate the efficiency of transfection. The site directed-mutation frequency was assessed by T7 endonuclease assay, and cell clones were analyzed for mtDNA copy number by Sanger DNA sequencing. We achieved  transfection efficiency of 51.3%. We selected 23 successfully transformed clones  for further analysis, and seven of these exhibited directed mutations at the CRISPR/Cas9 targeted site. Moreover, we also found a decrease in mtDNA copy number in the gene edited clones compared to that in the controls. These TFAM gene mutant cells were viable in culture when supplemented with uridine and pyruvate. We conclude that this CRISPR/Cas9 design was efficient, resulting in seven heterozygous mutant clones and opening up the possibility to use these mutant cell lines as a model system to elucidate the role of TFAM in the maintenance of mtDNA integrity.","cow","ミトコンドリア転写因子A（TFAM）は、転写の開始とゲノムの維持に不可欠なミトコンドリアDNA（mtDNA）結合タンパク質です。最近、TFAMの主な役割はmtDNAの完全性を維持することであり、それがmtDNAコピー数の重要な調節因子であることが実証されました。TFAMがmtDNAストレスを介した炎症反応において中心的な役割を果たすことも示されました。私たちの研究では、TFAMがmtDNAの複製特異性を調節するため、ウシ線維芽細胞でCRISPR / Cas9テクノロジーによってTFAM遺伝子を編集する可能性を評価することを提案しました。TFAM遺伝子はノックアウトマウスとニワトリで致死的であることが知られているため、mtDNAなしで生存できるRhoゼロ細胞を模倣するために、ウリジンとピルビン酸を添加した培地でこれらの細胞を培養後の培養で維持しようとしました。さらに、mtDNAコピー数に対するTFAM修飾の影響を評価しました。CRISPR gRNAは、ウシTFAM遺伝子のエクソン1を標的とするように設計され、その後クローン化されました。線維芽細胞にCas9とコントロールプラスミドをトランスフェクトしました。トランスフェクションの24時間後、トランスフェクションの効率を評価するために細胞をフローサイトメトリーで分析しました。部位特異的変異頻度はT7エンドヌクレアーゼアッセイによって評価され、細胞クローンはサンガーDNAシーケンシングによってmtDNAコピー数について分析されました。51.3％のトランスフェクション効率を達成しました。さらなる分析のために23の正常に変換されたクローンを選択し、これらのうち7つはCRISPR / Cas9ターゲットサイトで有向変異を示しました。さらに、コントロールと比較して、遺伝子編集されたクローンのmtDNAコピー数の減少も発見しました。これらのTFAM遺伝子変異細胞は、ウリジンとピルビン酸を補充した場合、培養で生存可能でした。このCRISPR / Cas9設計は効率的であり、7つのヘテロ接合変異クローンが得られ、mtDNAの完全性の維持におけるTFAMの役割を解明するためのモデルシステムとしてこれらの変異細胞株を使用する可能性が開かれたと結論付けます。"]
[15,30811458,"animal","cow","CRISPR;Cas9;","ankyrin-repeat and SOCS-box protein 9","PloS one","Gonadotropin regulation of ankyrin-repeat and SOCS-box protein 9 (ASB9) in ovarian follicles and identification of binding partners.",2019,"14(2):e0212571","[Benoit G et al.]","Universite de Montreal, St-Hyacinthe, Quebec, Canada.",30811458,"10.1371/journal.pone.0212571 ","Ankyrin-repeat and SOCS-box protein 9 (ASB9) is a member of the large SOCS-box containing proteins family and acts as the specific substrate recognition component of E3 ubiquitin ligases in the process of ubiquitination and proteasomal degradation. We previously identified ASB9 as a differentially expressed gene in granulosa cells (GC) of bovine ovulatory follicles. This study  aimed to further investigate ASB9 mRNA and protein regulation, identify binding partners in GC of bovine ovulatory follicles, and study its function. GC were obtained from small follicles (SF: 2-4 mm), dominant follicles at day 5 of the estrous cycle (DF), and ovulatory follicles, 24 hours following hCG injection (OF). Analyses by RT-PCR showed a 104-fold greater expression of ASB9 in GC of OF than in DF. Steady-state levels of ASB9 in follicular walls (granulosa and theca  cells) analyzed at 0, 6, 12, 18 and 24 hours after hCG injection showed a significant induction of ASB9 expression at 12 and 18 hours, reaching a maximum induction of 10.2-fold at 24 hours post-hCG as compared to 0 hour. These results  were confirmed in western blot analysis showing strongest ASB9 protein amounts in OF. Yeast two-hybrid screening of OF-cDNAs library resulted in the identification of 10 potential ASB9 binding partners in GC but no interaction was found between  ASB9 and creatine kinase B (CKB) in these GC. Functional studies using CRISPR-Cas9 approach revealed that ASB9 inhibition led to increased GC proliferation and modulation of target genes expression. Overall, these results support a physiologically relevant role of ASB9 in the ovulatory follicle by targeting specific proteins likely for degradation, contributing to reduced GC proliferation, and could be involved in the final GC differentiation into luteal  cells.","cow","アンキリンリピートおよびSOCSボックスタンパク質9（ASB9）は、タンパク質ファミリーを含む大きなSOCSボックスのメンバーであり、ユビキチン化およびプロテアソーム分解の過程でE3ユビキチンリガーゼの特定の基質認識コンポーネントとして機能します。我々は以前、ASB9をウシ卵胞の顆粒膜細胞（GC）で差次的に発現する遺伝子として同定しました。この研究は、ASB9 mRNAおよびタンパク質調節をさらに調査し、ウシ排卵濾胞のGCにおける結合パートナーを特定し、その機能を研究することを目的とした。GCは、小さな卵胞（SF：2〜4 mm）、発情周期（DF）の5日目の優勢な卵胞、およびhCG注射（OF）の24時間後の排卵卵胞から得られました。RT-PCRによる分析では、DFよりもOFのGCで104倍高いASB9の発現が示されました。hCG注射後0、6、12、18および24時間で分析された卵胞壁（顆粒膜細胞および卵胞膜細胞）におけるASB9の定常状態レベルは、12および18時間でASB9発現の有意な誘導を示し、10.2の最大誘導に達した。 0時間と比較してhCG後24時間で折りたたむ。これらの結果は、OFで最も強いASB9タンパク質量を示すウエスタンブロット分析で確認されました。OF-cDNAライブラリーの酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、GCで10の潜在的なASB9結合パートナーが同定されましたが、これらのGCではASB9とクレアチンキナーゼB（CKB）の間に相互作用は見られませんでした。CRISPR-Cas9アプローチを使用した機能研究により、ASB9阻害がGC増殖の増加と標的遺伝子発現の調節につながることが明らかになりました。全体として、これらの結果は、分解の可能性が高い特定のタンパク質を標的とし、GC増殖の低下に寄与し、黄体細胞への最終的なGC分化に関与する可能性があることにより、排卵卵胞におけるASB9の生理学的に関連する役割をサポートします。"]
[16,31245944,"animal","cow","CRISPRi","EGR1","Zhongguo ying yong sheng li xue za zhi = Zhongguo yingyong shenglixue zazhi = Chinese journal of applied physiology","[Expression of EGR1 gene and location of EGR1 protein in differentiation of bovine skeletal muscle-derived satellite cells].",2019,"35(1):5-8","[Zhang WW et al.]","College of Life Sciences, Agriculture and Forestry, China.",31245944,"10.12047/j.cjap.5749.2019.002 ","OBJECTIVE: To investigate the expression of EGR1 gene and the localization of EGR1 protein in bovine skeletal muscle-derived satellite cells (MDSCs), as well as to investigate the mechanism that EGR1 protein enters the nucleus. METHODS: Bovine MDSCs were cultured in differentiation medium for 1 day, 3 days and 5 days, respectively, and each group was triplicate. The expression of EGR1 gene and the localization of EGR1 protein were studied at different differentiation period in MDSCs by qRT-PC and Western blot. Moreover, the changes on the expression of endogenous EGR1 gene and EGR1 proteins were explored by CRISPRi, site-directed mutagenesis and laser confocal method. RESULTS: The results from the qRT-PCR and Western blot showed that the expressions of EGR1 gene on transcription level and translation level were significantly higher in differentiated cells than those in undifferentiated cells. The highest expression was found on the third day after the differentiation, and then began to decline.  Immunofluorescence assays showed that EGR1 proteins were preferentially expressed in differentiated MDSCs, and increased along with the increase of number of myotubes. Confocal observation revealed that some EGR1 proteins were transferred  into the nucleus in the differentiation of cells, however, the EGR1 proteins would not be detected in the differentiated MDSCs nuclei if a site directed mutagenesis (serine533) on EGR1 protein occurred. CONCLUSION: During the differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells, the transcriptional level of EGR1 gene is increased, and some EGR1 proteins are transferred into the  nucleus. The serine phosphorylation at position 533 of the C terminal of EGR1 protein is necessary for the nucleus transfer.","cow","目的：ウシ骨格筋由来衛星細胞（MDSC）におけるEGR1遺伝子の発現とEGR1タンパク質の局在を調査し、EGR1タンパク質が核に入るメカニズムを調査すること。方法：ウシMDSCを分化培地でそれぞれ1日、3日、5日間培養し、各グループを3回ずつ培養しました。EGR1遺伝子の発現とEGR1タンパク質の局在は、qRT-PCとウエスタンブロットによってMDSCの異なる分化期間で研究されました。さらに、内因性EGR1遺伝子およびEGR1タンパク質の発現の変化は、CRISPRi、部位特異的突然変異誘発およびレーザー共焦点法によって調査されました。結果：qRT-PCRおよびウエスタンブロットの結果は、転写レベルおよび翻訳レベルでのEGR1遺伝子の発現が、未分化細胞よりも分化細胞で有意に高かったことを示しました。最も高い発現は分化後3日目に見られ、その後低下し始めた。免疫蛍光アッセイは、EGR1タンパク質が分化したMDSCで優先的に発現され、筋管の数の増加とともに増加することを示しました。共焦点観察により、一部のEGR1タンパク質が細胞の分化において核に移行したことが明らかになりましたが、EGR1タンパク質の部位特異的変異誘発（serine533）が発生した場合、EGR1タンパク質は分化したMDSC核では検出されませんでした。結論：ウシ骨格筋衛星細胞の分化中に、EGR1遺伝子の転写レベルが増加し、一部のEGR1タンパク質が核に移行します。EGR1タンパク質のC末端の533位でのセリンリン酸化は核移行に必要です。"]
[17,31095680,"animal","cow; pig","CRISPR;Cas9;","Nanos2","Biology of reproduction","Simplified pipelines for genetic engineering of mammalian embryos by CRISPR-Cas9  electroporationdagger.",2019,"101(1):177-187","[Miao D et al.]","Washington State University, Pullman, WA, USA.",31095680,"10.1093/biolre/ioz075 ","Gene editing technologies, such as CRISPR-Cas9, have important applications in mammalian embryos for generating novel animal models in biomedical research and lines of livestock with enhanced production traits. However, the lack of methods  for efficient introduction of gene editing reagents into zygotes of various species and the need for surgical embryo transfer in mice have been technical barriers of widespread use. Here, we described methodologies that overcome these  limitations for embryos of mice, cattle, and pigs. Using mutation of the Nanos2 gene as a readout, we refined electroporation parameters with preassembled sgRNA-Cas9 RNPs for zygotes of all three species without the need for zona pellucida dissolution that led to high-efficiency INDEL edits. In addition, we optimized culture conditions to support maturation from zygote to the multicellular stage for all three species that generates embryos ready for transfer to produce gene-edited animals. Moreover, for mice, we devised a nonsurgical embryo transfer method that yields offspring at an efficiency comparable to conventional surgical approaches. Collectively, outcomes of these studies provide simplified pipelines for CRISPR-Cas9-based gene editing that are  applicable in a variety of mammalian species.","cow; pig","CRISPR-Cas9などの遺伝子編集技術は、哺乳類の胚において、生物医学研究や生産特性が強化された家畜の系統で新しい動物モデルを生成するための重要なアプリケーションを持っています。しかし、さまざまな種の接合子に遺伝子編集試薬を効率的に導入する方法がないこと、およびマウスでの外科的胚移植の必要性は、広く使用される技術的な障壁となっています。ここでは、マウス、牛、豚の胚のこれらの制限を克服する方法論について説明しました。Nanos2遺伝子の変異を読み出しとして使用し、高効率のINDEL編集につながる透明帯の溶解を必要とせずに、3種すべての接合子の事前に組み立てられたsgRNA-Cas9RNPを使用してエレクトロポレーションパラメーターを改良しました。さらに、培養条件を最適化して、遺伝子編集された動物を生産するための移植の準備ができた胚を生成する3つの種すべての接合子から多細胞段階への成熟をサポートします。さらに、マウスについては、従来の外科的アプローチに匹敵する効率で子孫を産む非外科的胚移植法を考案しました。まとめると、これらの研究の結果は、さまざまな哺乳類種に適用可能なCRISPR-Cas9ベースの遺伝子編集のための簡素化されたパイプラインを提供します。"]
[18,30981084,"animal","Alpas cashmere goat","CRISPR;Cas9;TALENs;","myostatin","Theriogenology","Comparison of gene editing efficiencies of CRISPR/Cas9 and TALEN for generation of MSTN knock-out cashmere goats.",2019,"132:1-11","[Zhang J et al.]","Inner Mongolia University, Hohhot, China.",30981084,"10.1016/j.theriogenology.2019.03.029 ","The genome editors CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/Cas9 nuclease-null) and TALENs (transcription activator-like effector nuclease) are popularly used for targeted modification of the mammalian  genome. To date, few comparative studies have been carried out to investigate the differences between the use of CRISPR/Cas9 and TALENs in genome editing for goat  breeding. Here, we compared CRISPR/Cas9 and TALEN technologies at multiple levels for generating a knock out (KO) of the Alpas cashmere goat myostatin (MSTN) gene, which negatively regulates the proliferation and differentiation of skeletal muscle cells. The electrotransfection efficiency observed using CRISPR/Cas9 was 8.1% more than that observed using TALEN for generating MSTN KO cells. In addition, the cutting efficiency of CRISPR/Cas9 for editing exon 1 of the MSTN gene was higher than that of TALENs. However, the off-target effects of the CRISPR/Cas9 system were also higher than those of TALENs. Further, we found that  the frequency of obtaining MSTN(-/-) mutations by CRISPR/Cas9 was 8.5 times higher than that by TALEN. The CRISPR/Cas9-edited colonies involved longer deletions (up to 117 bp) than the TALEN-edited colonies (up to 13 bp). Remarkably, when embryos used to generate cloned goat via somatic cell nuclear transfer were compared, we found that the TALEN MSTN KO embryos easily developed  to 8cells and their cleavage rate was significantly higher than that of CRISPR/Cas9-edited embryos. Finally, we produced a MSTN KO lamb using CRISPR/Cas9, which suggested that a high level of targeted gene modification could be achieved in goat using CRISPR/Cas9. Taken together, our study indicates  that although TALEN enables a variety of genome modifications and may have some advantages over CRISPR/Cas9, the latter provides a significant advantage by permitting precise and efficient gene editing. Thus, CRISPR/Cas9 has more potential to become a robust gene-engineering tool for application in the breeding of farm animals.","goat","ゲノムエディターCRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ Cas9ヌクレアーゼヌル）およびTALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）は、哺乳類ゲノムの標的修飾に広く使用されています。現在まで、ヤギ育種のためのゲノム編集におけるCRISPR / Cas9とTALENの使用の違いを調査するための比較研究はほとんど行われていません。ここでは、骨格筋細胞の増殖と分化を負に調節するAlpasカシミアヤギミオスタチン（MSTN）遺伝子のノックアウト（KO）を生成するために、CRISPR / Cas9とTALENテクノロジーを複数のレベルで比較しました。CRISPR / Cas9を使用して観察されたエレクトロトランスフェクション効率は、MSTNKO細胞を生成するためにTALENを使用して観察されたものより8.1％高かった。さらに、MSTN遺伝子のエクソン1を編集するためのCRISPR / Cas9の切断効率はTALENのそれよりも高かった。ただし、CRISPR / Cas9システムのオフターゲット効果もTALENの効果よりも高かった。さらに、CRISPR / Cas9によるMSTN（-/-）変異の取得頻度は、TALENによる頻度の8.5倍であることがわかりました。CRISPR / Cas9で編集されたコロニーは、TALENで編集されたコロニー（最大13 bp）よりも長い欠失（最大117 bp）を伴いました。注目すべきことに、体細胞核移植を介してクローンヤギを生成するために使用された胚を比較すると、TALEN MSTN KO胚は8細胞に容易に発達し、それらの切断率はCRISPR / Cas9編集胚よりも有意に高かった。最後に、CRISPR / Cas9を使用してMSTNKOラムを作成しました。これは、CRISPR / Cas9を使用してヤギで高レベルの標的遺伝子改変を達成できることを示唆しています。まとめると、私たちの研究は、TALENがさまざまなゲノム修飾を可能にし、CRISPR / Cas9に比べていくつかの利点があるかもしれないが、後者は正確で効率的な遺伝子編集を可能にすることによって大きな利点を提供することを示しています。したがって、CRISPR / Cas9は、家畜の繁殖に適用するための堅牢な遺伝子工学ツールになる可能性が高くなります。"]
[19,31360116,"animal","goat","CRISPR;Cas9;","Tbeta4; CCR5","International journal of biological sciences","Generation of Tbeta4 knock-in Cashmere goat using CRISPR/Cas9.",2019,"15(8):1743-1754","[Li X et al.]","Inner Mongolia University, Hohhot, China.",31360116,"10.7150/ijbs.34820 ","The cashmere goat breed is known to provide excellent quality cashmere. Here, we  attempted to breed high-yielding cashmere goats by specifically inserting the Tbeta4 gene into the goat CCR5 locus and provided an animal model for future research. We successfully obtained Tbeta4 knock-in goat without any screening and fluorescent markers using CRISPR/Cas9 technology. A series of experiments were performed to examine physical conditions and characteristics of the Tbeta4 knock-in goat. The goat exhibited an increase in cashmere yield by 74.5% without  affecting the fineness and quality. Additionally, RNA-seq analysis indicated that Tbeta4 may promote hair growth by affecting processes such as vasoconstriction, angiogenesis, and vascular permeability around secondary hair follicles. Together, our study can significantly improve the breeding of cashmere goat and thereby increase economic efficiency.","goat","カシミヤヤギの品種は、優れた品質のカシミヤを提供することが知られています。ここでは、Tbeta4遺伝子をヤギのCCR5遺伝子座に特異的に挿入することにより、高収量のカシミヤヤギの繁殖を試み、将来の研究のための動物モデルを提供しました。CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して、スクリーニングや蛍光マーカーなしでTbeta4ノックインヤギを取得することに成功しました。Tbeta4ノックインヤギの体調と特徴を調べるために一連の実験が行われました。ヤギは、細かさや品質に影響を与えることなく、カシミヤの収量が74.5％増加しました。さらに、RNA-seq分析は、Tbeta4が血管収縮、血管新生、二次毛包周辺の血管透過性などのプロセスに影響を与えることにより、発毛を促進する可能性があることを示しました。一緒に、私たちの研究はカシミヤヤギの繁殖を大幅に改善し、それによって経済効率を高めることができます。"]
[20,31079595,"animal","goat","CRISPR;Cas9;"," ","Reproduction, fertility, and development","Optimisation of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9:single-guide RNA (sgRNA) delivery system in a goat model.",2019,null,"[Huang Y et al.]","Northwest A&F University, Yangling, China",31079595,"10.1071/RD18485 ","The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system is an efficient method for the production of gene-edited animals. We have  successfully generated gene-modified goats and sheep via zygote injection of Cas9 mRNA and single-guide RNA (sgRNA) mixtures. However, the delivery system for microinjection largely refers to methods established for mice; optimised injection conditions are urgently required for the generation of large animals. Here, we designed a study to optimise the Cas9 mRNA and sgRNA delivery system for goats. By comparing four computational tools for sgRNA design and validating the  targeting efficiency in goat fibroblasts, we suggest a protocol for the selection of desirable sgRNAs with higher targeting efficiency and negligible off-target mutations. We further evaluated the editing efficiency in goat zygotes injected with Cas9:sgRNA (sg8) and found that injection with 50ngmuL-1 Cas9 mRNA and 25ngmuL-1 sgRNA yielded an increased editing efficiency. Our results provide a reference protocol for the optimisation of the injection conditions for the efficient editing of large animal genomes via the zygote injection approach.","goat","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9システムは、遺伝子編集された動物の生産のための効率的な方法です。Cas9 mRNAとシングルガイドRNA（sgRNA）混合物の接合子注入により、遺伝子改変ヤギとヒツジの生成に成功しました。ただし、マイクロインジェクションの配信システムは、主にマウス用に確立された方法を指します。大型動物の飼育には、最適化された注射条件が緊急に必要です。ここでは、ヤギのCas9mRNAおよびsgRNAデリバリーシステムを最適化するための研究を設計しました。sgRNA設計のための4つの計算ツールを比較し、ヤギ線維芽細胞のターゲティング効率を検証することにより、より高いターゲティング効率と無視できるオフターゲット変異を持つ望ましいsgRNAを選択するためのプロトコルを提案します。さらに、Cas9：sgRNA（sg8）を注入したヤギ接合子の編集効率を評価し、50ngmuL-1 Cas9mRNAと25ngmuL-1sgRNAを注入すると編集効率が向上することを発見しました。私たちの結果は、接合子注入アプローチを介して大きな動物のゲノムの効率的な編集のための注入条件の最適化のための参照プロトコルを提供します。"]
[21,31309000,"animal","Shaanbei white cashmere goat","CRISPR;Cas9;","vitamin D receptor","PeerJ","CRISPR/Cas9-mediated VDR knockout plays an essential role in the growth of dermal papilla cells through enhanced relative genes.",2019,"7:e7230","[Gao Y et al.]","Shanxi Datong University, Datong, China.",31309000,"10.7717/peerj.7230 ","Background: Hair follicles in cashmere goats are divided into primary and secondary hair follicles (HFs). HF development, which determines the morphological structure, is regulated by a large number of vital genes; however,  the key functional genes and their interaction networks are still unclear. Although the vitamin D receptor (VDR) is related to cashmere goat HF formation, its precise effects are largely unknown. In the present study, we verified the functions of key genes identified in previous studies using hair dermal papilla (DP) cells as an experimental model. Furthermore, we used CRISPR/Cas9 technology  to modify the VDR in DP cells to dissect the molecular mechanism underlying HF formation in cashmere goats. Results: The VDR expression levels in nine tissues of Shaanbei white cashmere goats differed significantly between embryonic day 60  (E60) and embryonic day 120 (E120). At E120, VDR expression was highest in the skin. At the newborn and E120 stages, the VDR protein was highly expressed in the root sheath and hair ball region of Shaanbei cashmere goats. We cloned the complete CDS of VDR in the Shaanbei white cashmere goat and constructed a VDR-deficient DP cell model by CRISPR/Cas9. Heterozygous and homozygous mutant DP cells were produced. The growth rate of mutant DP cells was significantly lower than that of wild-type DP cells (P < 0.05) and VDR mRNA levels in DP cells decreased significantly after VDR knockdown (P < 0.05). Further, the expression levels of VGF, Noggin, Lef1, and beta-catenin were significantly downregulated (P < 0.05). Conclusions: Our results indicated that VDR has a vital role in DP cells, and that its effects are mediated by Wnt and BMP4 signaling.","goat","背景：カシミヤヤギの毛包は、一次毛包と二次毛包（HF）に分けられます。形態学的構造を決定するHFの発生は、多数の重要な遺伝子によって制御されています。ただし、主要な機能遺伝子とそれらの相互作用ネットワークはまだ不明です。ビタミンD受容体（VDR）はカシミヤヤギのHF形成に関連していますが、その正確な効果はほとんど知られていません。本研究では、実験モデルとして毛髪真皮乳頭（DP）細胞を使用して以前の研究で特定された重要な遺伝子の機能を検証しました。さらに、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してDP細胞のVDRを変更し、カシミヤヤギのHF形成の根底にある分子メカニズムを分析しました。結果：Shaanbei白カシミヤヤギの9つの組織におけるVDR発現レベルは、胚の60日目（E60）と胚の120日目（E120）の間で有意に異なっていました。E120では、VDRの発現は皮膚で最も高かった。新生児期とE120期では、VDRタンパク質はShaanbeiカシミヤヤギの根鞘と毛玉領域で高度に発現していました。ShaanbeiホワイトカシミヤヤギにVDRの完全なCDSのクローンを作成し、CRISPR / Cas9によってVDR欠損DPセルモデルを構築しました。ヘテロ接合性およびホモ接合性の変異DP細胞が産生された。変異型DP細胞の増殖速度は野生型DP細胞の増殖速度よりも有意に低く（P <0.05）、DP細胞のVDR mRNAレベルはVDRノックダウン後に有意に減少しました（P <0.05）。さらに、VGF、Noggin、Lef1、およびベータカテニンの発現レベルは有意にダウンレギュレートされました（P <0.05）。結論：私たちの結果は、VDRがDP細胞において重要な役割を果たし、その効果がWntおよびBMP4シグナル伝達によって媒介されることを示しました。"]
[22,31456163,"animal","Bama miniature pig","CRISPR;Cas9;","GHR","In vitro cellular & developmental biology. Animal","Efficient generation of GHR knockout Bama minipig fibroblast cells using CRISPR/Cas9-mediated gene editing.",2019,"55(10):784-792","[Wang R et al.]","Guangxi University, Nanning, China.",31456163,"10.1007/s11626-019-00397-6 ","Dwarfism, also known as growth hormone deficiency (GHD), is a disease caused by genetic mutations that result in either a lack of growth hormone or insufficient  secretion of growth hormone, resulting in a person's inability to grow normally.  In the past, many studies focusing on GHD have made use of models of other diseases such as metabolic or infectious diseases. A viable GHD specific model system has not been used previously, thus limiting the interpretation of GHD results. The Bama minipig is unique to Guangxi province and has strong adaptability and disease resistance, and an incredibly short stature, which is especially important for the study of GHD. In addition, studies of GHR knockout Bama minipigs and GHR knockout Bama minipig fibroblast cells generated using CRISPR/Cas9 have not been previously reported. Therefore, the Bama minipig was selected as an animal model and as a tool for the study of GHD in this work. In this study, a Cas9 plasmid with sgRNA targeting the first exon of the GHR gene was transfected into Bama minipig kidney fibroblast cells to generate 22 GHR knockout Bama minipig kidney fibroblast cell lines (12 male monoclonal cells and  10 female monoclonal cells). After culture and identification, 11 of the 12 male  clone cell lines showed double allele mutations, and the rate of positive alteration of GHR was 91.67%. Diallelic mutation of the target sequence occurred  in 10 female clonal cell lines, with an effective positive mutation rate of 100%. Our experimental results not only showed that CRISPR/Cas9 could efficiently be used for gene editing in Bama minipig cells but also identified a highly efficient target site for the generation of a GHR knockout in other porcine models. Thus, the generation of GHR knockout male and female Bama fibroblast cells could lay a foundation for the birth of a future dwarfism model pig. We anticipate that the \"mini\" Bama minipig will be of improved use for biomedical and agricultural scientific research and for furthering our understanding of the  genetic underpinnings of GHD.","pig","成長ホルモン欠乏症（GHD）としても知られる小人症は、成長ホルモンの不足または成長ホルモンの分泌不足を引き起こし、正常に成長できなくなる遺伝子変異によって引き起こされる病気です。これまで、GHDに焦点を当てた多くの研究では、代謝性疾患や感染症などの他の疾患のモデルを利用してきました。実行可能なGHD固有のモデルシステムはこれまで使用されていなかったため、GHD結果の解釈が制限されていました。バマミニブタは広西チワン族自治区に特有であり、強い適応性と耐病性、そして信じられないほど低身長であり、これはGHDの研究にとって特に重要です。さらに、CRISPR / Cas9を使用して生成されたGHRノックアウトBamaミニブタおよびGHRノックアウトBamaミニブタ線維芽細胞の研究はこれまで報告されていません。したがって、バマミニブタは、動物モデルとして、そしてこの研究におけるGHDの研究のためのツールとして選ばれました。この研究では、GHR遺伝子の最初のエキソンを標的とするsgRNAを含むCas9プラスミドをBama minipig腎臓線維芽細胞にトランスフェクトして、22のGHRノックアウトBama minipig腎臓線維芽細胞株（12の男性モノクローナル細胞と10の女性モノクローナル細胞）を生成しました。培養および同定後、12の雄クローン細胞株のうち11が二重対立遺伝子変異を示し、GHRの陽性変化率は91.67％でした。標的配列のダイアレル変異は、10の女性クローン細胞株で発生し、有効な陽性変異率は100％でした。私たちの実験結果は、CRISPR / Cas9がBamaミニブタ細胞の遺伝子編集に効率的に使用できることを示しただけでなく、他のブタモデルでGHRノックアウトを生成するための非常に効率的な標的部位を特定しました。したがって、GHRノックアウトのオスとメスのバマ線維芽細胞の生成は、将来の小人症モデルブタの誕生の基礎を築く可能性があります。「ミニ」バマミニブタは、生物医学および農業科学研究、およびGHDの遺伝的基盤の理解を深めるために改善された用途になると期待しています。"]
[23,31451425,"animal","Bama miniature pig","CRISPR;Cas9;","oxysterol binding protein like 2","Journal of genetics and genomics = Yi chuan xue bao","OSBPL2-disrupted pigs recapitulate dual features of human hearing loss and hypercholesterolaemia.",2019,"46(8):379-387","[Yao J et al.]","Nanjing Medical  University, Nanjing, China.",31451425,"10.1016/j.jgg.2019.06.006 ","Oxysterol binding protein like 2 (OSBPL2), an important regulator in cellular lipid metabolism and transport, was identified as a novel deafness-causal gene in our previous work. To resemble the phenotypic features of OSBPL2 mutation in animal models and elucidate the potential genotype-phenotype associations, the OSBPL2-disrupted Bama miniature (BM) pig model was constructed using CRISPR/Cas9-mediated gene editing, somatic cell nuclear transfer (SCNT) and embryo transplantation approaches, and then subjected to phenotypic characterization of auditory function and serum lipid profiles. The OSBPL2-disrupted pigs displayed progressive hearing loss (HL) with degeneration/apoptosis of cochlea hair cells (HCs) and morphological abnormalities in HC stereocilia, as well as hypercholesterolaemia. High-fat diet  (HFD) feeding aggravated the development of HL and led to more severe hypercholesterolaemia. The dual phenotypes of progressive HL and hypercholesterolaemia resembled in OSBPL2-disrupted pigs confirmed the implication of OSBPL2 mutation in nonsydromic hearing loss (NSHL) and contributed to the potential linkage between auditory dysfunction and dyslipidaemia/hypercholesterolaemia.","pig","細胞の脂質代謝と輸送における重要な調節因子である2のようなオキシステロール結合タンパク質（OSBPL2）は、私たちの以前の研究で新しい難聴の原因遺伝子として同定されました。動物モデルにおけるOSBPL2変異の表現型の特徴に類似し、潜在的な遺伝子型と表現型の関連を解明するために、OSBPL2が破壊されたBamaミニチュア（BM）ブタモデルは、CRISPR / Cas9を介した遺伝子編集、体細胞核移植（SCNT）および胚移植アプローチ、そしてその後、聴覚機能と血清脂質プロファイルの表現型の特徴づけにかけられます。OSBPL2が破壊されたブタは、蝸牛有毛細胞（HC）の変性/アポトーシス、HC不動毛の形態異常、および高コレステロール血症を伴う進行性難聴（HL）を示しました。高脂肪食（HFD）の給餌は、HLの発症を悪化させ、より重度の高コレステロール血症を引き起こしました。進行性HLと高コレステロール血症の二重表現型はOSBPL2破壊ブタに類似しており、非症候性難聴（NSHL）におけるOSBPL2変異の影響を確認し、聴覚機能障害と脂質異常症/高コレステロール血症との潜在的な関連性に寄与しました。"]
[24,30488155,"animal","Liang Guang Small Spotted pig","CRISPR;Cas9;","insulin-like growth factor 2","Transgenic research","Disruption of the ZBED6 binding site in intron 3 of IGF2 by CRISPR/Cas9 leads to  enhanced muscle development in Liang Guang Small Spotted pigs.",2019,"28(1):141-150","[Liu X et al.]","Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.",30488155,"10.1007/s11248-018-0107-9 ","Insulin-like growth factor 2 (IGF2) plays an important role in the development of the foetus and in post-natal growth and development. A SNP within intron 3 of porcine IGF2 disrupts a binding site for the repressor, zinc finger BED-type containing 6 (ZBED6), leading to up-regulation of IGF2 in skeletal muscle and major effects on muscle growth, heart size, and fat deposition. This favourable mutation is common in Western commercial pig populations, but is not present in most indigenous Chinese pig breeds. Here, we described the efficient disruption of the ZBED6 binding site motif in intron 3 of IGF2 by CRISPR/Cas9 in porcine embryonic fibroblasts (PEFs) from the indigenous Chinese pig breed, Liang Guang Small Spotted pig. Disruption of the binding motif led to a drastic up-regulation of IGF2 expression in PEFs and enhanced myogenic potential and cell proliferation of PEFs. IGF2-edited pigs were then generated using somatic cell nuclear transfer. Enhanced muscle development was evident in one pig with biallelic deletion of the ZBED6 binding site motif, implying that the release of ZBED6 repression has a major effect on porcine muscle development. Our study confirmed  the important effect of a mutation in the ZBED6 binding site motif on IGF2 expression and myogenesis, thus providing the basis for breeding a new line of Liang Guang Small Spotted pigs with improved lean meat percentage, a trait of great commercial value to pig producers.","pig","インスリン様成長因子2（IGF2）は、胎児の発育および出生後の成長と発育に重要な役割を果たします。ブタIGF2のイントロン3内のSNPは、リプレッサーである6を含む亜鉛フィンガーBEDタイプ（ZBED6）の結合部位を破壊し、骨格筋におけるIGF2のアップレギュレーションを引き起こし、筋肉の成長、心臓のサイズ、脂肪沈着に大きな影響を与えます。 。この好ましい突然変異は、西洋の商業用豚集団で一般的ですが、ほとんどの先住民族の中国の豚の品種には存在しません。ここでは、中国固有のブタ品種であるLiang Guang Small Spotted pigのブタ胚性線維芽細胞（PEF）において、CRISPR / Cas9によるIGF2のイントロン3のZBED6結合部位モチーフの効率的な破壊について説明しました。結合モチーフの破壊は、PEFにおけるIGF2発現の劇的なアップレギュレーションをもたらし、PEFの筋原性の可能性と細胞増殖を増強しました。次に、IGF2で編集されたブタは、体細胞核移植を使用して生成されました。強化された筋肉の発達は、ZBED6結合部位モチーフの二対立遺伝子の欠失を伴う1匹のブタで明らかであり、ZBED6抑制の解放がブタの筋肉の発達に大きな影響を与えることを意味します。私たちの研究は、IGF2の発現と筋形成に対するZBED6結合部位モチーフの変異の重要な影響を確認しました。これにより、赤身の肉の割合が改善されたLiang Guang Small Spotted豚の新系統を繁殖させるための基礎が提供され、豚にとって大きな商業的価値があります。プロデューサー。"]
[25,30913397,"animal","meishan pig","ZFN;","myostatin","Genome","An integrated analysis of mRNA and miRNA in skeletal muscle from myostatin-edited Meishan pigs.",2019,"62(5):305-315","[Xie S et al.]","Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",30913397,"10.1139/gen-2018-0110 ","Myostatin (MSTN) is a key muscle factor that negatively regulates skeletal muscle growth and development. Our laboratory recently produced genetically engineered Meishan pigs containing a ZFN-edited MSTN loss-of-function mutation (MSTN(-/-), MKO) that led to the hypertrophy of skeletal muscles. In this study, we performed transcriptome sequencing and miRNA sequencing in skeletal muscle samples from MKO and wildtype Meishan (MWT) pigs to investigate the effect of MSTN(-/-) on expression of mRNA and miRNA. Our results indicated that, compared to MWT pigs, there were 200 genes and 4 miRNAs being significantly up-regulated, and 238 genes and 5 miRNAs being significantly down-regulated in MKO pigs. Analysis by GO and KEGG pathways revealed that differentially expressed miRNAs and their target genes of those differentially expressed miRNAs were involved in the signal pathways of skeletal muscle growth and development such as AMPK, mTOR, and TGF-beta. An integrated analysis of the correlation between miRNA-mRNA and transcriptome predicated that XK and METTL8 were target genes for miR-499-5p, while LRP4 was a target gene for miR-490-3p. Our results provide important clues  to help us further investigate MSTN's regulatory mechanisms during skeletal muscle growth and development.","pig","ミオスタチン（MSTN）は、骨格筋の成長と発達を負に調節する重要な筋肉因子です。私たちの研究室は最近、骨格筋の肥大を引き起こすZFN編集MSTN機能喪失変異（MSTN（-/-）、MKO）を含む遺伝子操作された梅山豚を生産しました。この研究では、MKOおよび野生型梅山（MWT）ブタの骨格筋サンプルでトランスクリプトームシーケンスとmiRNAシーケンスを実行し、mRNAとmiRNAの発現に対するMSTN（-/-）の影響を調査しました。私たちの結果は、MWT豚と比較して、MKO豚では200個の遺伝子と4個のmiRNAが有意にアップレギュレートされ、238個の遺伝子と5個のmiRNAが有意にダウンレギュレートされていることを示しました。GOおよびKEGG経路による分析により、発現差のあるmiRNAと、それらの発現差のあるmiRNAの標的遺伝子が、AMPK、mTOR、TGF-betaなどの骨格筋の成長と発達のシグナル経路に関与していることが明らかになりました。miRNA-mRNAとトランスクリプトームの相関関係の統合分析では、XKとMETTTL8がmiR-499-5pの標的遺伝子であり、LRP4がmiR-490-3pの標的遺伝子であることが予測されました。私たちの結果は、骨格筋の成長と発達中のMSTNの調節メカニズムをさらに調査するのに役立つ重要な手がかりを提供します。"]
[26,30645618,"animal","Meishan pig","ZFN;","myostatin","PloS one","Effect of ZFN-edited myostatin loss-of-function mutation on gut microbiota in Meishan pigs.",2019,"14(1):e0210619","[Cui WT  et al.]","Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",30645618,"10.1371/journal.pone.0210619 ","Intestine contains the body's second largest genetic information, so a relatively stable microbiota ecosystems and interactions between intestinal micro-organisms  play a pivotal role in the normal growth and development in animals. The establishment of intestinal microflora is affected by a variety of factors such as species, environmental factors, developmental stage, organizational structure  and physiological characteristics of various parts of the digestive tract. Gene editing technology such as ZFN has recently been used as a new approach to replace the traditional transgenic technology and to make genetic modifications in animals. However, it is not known if genetic modification by gene editing technology will have any impact on gut microbiota. In this study, by sequencing 16S rRNA collected from rectum, we investigated the effects of ZFN-mediated myostatin (MSTN) loss-of-function mutation (MSTN-/-) on gut microbiota in Meishan pigs. Our results showed that the fecal microbial composition is very similar between MSTN-/- Meishan pigs and wild type Meishan pigs. Although significant differences in certain individual strains were observed, all the dominant microorganism species are basically the same between MSTN-/- and wild type pigs.  However, these differences do not adversely affect MSTN-/- Meishan pigs. Thus, it is concluded that ZFN-mediated MSTN loss-of-function mutation did not have any adverse effect on the gut microbiota in Meishan pigs.","pig","腸には体の2番目に大きな遺伝情報が含まれているため、比較的安定した微生物叢の生態系と腸内微生物間の相互作用が、動物の正常な成長と発達において極めて重要な役割を果たします。腸内細菌叢の確立は、種、環境要因、発達段階、組織構造、消化管のさまざまな部分の生理学的特性など、さまざまな要因の影響を受けます。ZFNなどの遺伝子編集技術は、従来のトランスジェニック技術に取って代わり、動物の遺伝子改変を行うための新しいアプローチとして最近使用されています。しかし、遺伝子編集技術による遺伝子改変が腸内細菌叢に影響を与えるかどうかは不明です。この研究では、直腸から収集した16S rRNAを配列決定することにより、梅山豚の腸内細菌叢に対するZFNを介したミオスタチン（MSTN）の機能喪失型変異（MSTN-/-）の影響を調査しました。我々の結果は、糞便の微生物組成がMSTN-/-梅山豚と野生型梅山豚の間で非常に類似していることを示した。特定の個々の菌株に有意差が観察されましたが、すべての優勢な微生物種は、MSTN-/-と野生型のブタの間で基本的に同じです。ただし、これらの違いはMSTN-/-梅山豚に悪影響を及ぼしません。したがって、ZFNを介したMSTNの機能喪失型変異は、梅山豚の腸内細菌叢に悪影響を及ぼさなかったと結論付けられます。"]
[27,31733031,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","beta2-microglobulin","American journal of transplantation","Triple (GGTA1, CMAH, B2M) modified pigs expressing an SLA class I(low) phenotype-Effects on immune status and susceptibility to human immune responses.",2019,null,"[Hein R et al.]","Hannover Medical School, Hannover, Germany.",31733031,"10.1111/ajt.15710 ","Porcine xenografts lacking swine leukocyte antigen (SLA) class I are thought to be protected from human T cell responses. We have previously shown that SLA class I deficiency can be achieved in pigs by CRISPR/Cas9-mediated deletion of beta2 -microglobulin (B2M). Here, we characterized another line of genetically modified pigs in which targeting of the B2M locus did not result in complete absence of B2M and SLA class I but rather in significantly reduced expression levels of both molecules. Residual SLA class I was functionally inert, because no proper differentiation of the CD8(+) T cell subset was observed in B2M(low) pigs. Cells  from B2M(low) pigs were less capable in triggering proliferation of human peripheral blood mononuclear cells in vitro, which was mainly due to the nonresponsiveness of CD8(+) T cells. Nevertheless, cytotoxic effector cells developing from unaffected cell populations (eg, CD4(+) T cells, natural killer cells) lysed targets from both SLA class I(+) wildtype and SLA class I(low) pigs  with similar efficiency. These data indicate that the absence of SLA class I is an effective approach to prevent the activation of human CD8(+) T cells during the induction phase of an anti-xenograft response. However, cytotoxic activity of cells during the effector phase cannot be controlled by this approach.","pig","ブタ白血球抗原（SLA）クラスIを欠くブタ異種移植片は、ヒトT細胞応答から保護されていると考えられています。SLAクラスI欠損症は、CRISPR / Cas9を介したβ2-ミクログロブリン（B2M）の欠失によってブタで達成できることを以前に示しました。ここでは、B2M遺伝子座のターゲティングがB2MおよびSLAクラスIの完全な欠如をもたらさず、むしろ両方の分子の発現レベルを大幅に低下させた遺伝子改変ブタの別の系統を特徴づけました。CD8（+）T細胞サブセットの適切な分化がB2M（低）ブタで観察されなかったため、残留SLAクラスIは機能的に不活性でした。B2M（low）ブタの細胞は、主にCD8（+）T細胞の無反応性が原因で、invitroでヒト末梢血単核細胞の増殖を誘発する能力が低かった。それにもかかわらず、影響を受けていない細胞集団（例えば、CD4（+）T細胞、ナチュラルキラー細胞）から発生する細胞毒性エフェクター細胞は、SLAクラスI（+）野生型とSLAクラスI（低）ブタの両方からの標的を同様の効率で溶解しました。これらのデータは、SLAクラスIの不在が、抗異種移植応答の誘導期にヒトCD8（+）T細胞の活性化を防ぐための効果的なアプローチであることを示しています。ただし、エフェクター段階での細胞の細胞毒性活性は、このアプローチでは制御できません。"]
[28,31558095,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","cd163","Animal biotechnology","Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes.",2019,"1-8","[Tanihara F et al.]","Tokushima University, Tokushima, Japan.",31558095,"10.1080/10495398.2019.1668801 ","CD163 is a putative fusion receptor for virus of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS). In this study, we introduced a CRISPR/Cas9 system [guide RNAs (gRNAs) with Cas9 protein] targeting the CD163 gene into in vitro-fertilized porcine zygotes by electroporation to generate CD163-modified pigs. First, we designed four types of gRNAs that targeted distinct sites in exon 7 of the CD163 gene. Cas9 protein with different gRNAs was introduced into in vitro-fertilized zygotes by electroporation. When the electroporated zygotes were allowed to develop to blastocysts in vitro and the genome editing efficiency was  evaluated using these blastocysts, three (gRNA1, 2, and 4) of the four gRNAs tested successfully edited the CD163 gene. To generate CD163-knockout pigs, a total of 200 electroporated zygotes using these three gRNAs were transferred into the oviducts of oestrous-synchronized surrogate and the surrogate gave birth to eight piglets. Subsequent sequence analysis revealed that one of the piglets carried no wild-type sequence in CD163 gene. The other seven piglets carried only wild-type sequence. Thus, we successfully generated a CD163-edited pig by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes, although further improvement is required to generate genetically modified pigs with high efficiency.","pig","CD163は、豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）のウイルスの推定融合受容体です。この研究では、CD163遺伝子を標的とするCRISPR / Cas9システム[Cas9タンパク質を含むガイドRNA（gRNA）]をエレクトロポレーションによりinvitroで受精したブタ接合子に導入してCD163修飾ブタを作製しました。まず、CD163遺伝子のエクソン7の異なる部位を標的とする4種類のgRNAを設計しました。異なるgRNAを持つCas9タンパク質は、エレクトロポレーションによって体外受精した接合子に導入されました。エレクトロポレーションした接合子をinvitroで胚盤胞に発達させ、これらの胚盤胞を使用してゲノム編集効率を評価したところ、テストした4つのgRNAのうち3つ（gRNA1、2、4）がCD163遺伝子の編集に成功しました。CD163ノックアウトブタを生成するために、これら3つのgRNAを使用して合計200のエレクトロポレーションされた接合子が発情同期代理母の卵管に移され、代理母は8頭の子豚を産みました。その後の配列分析により、子豚の1人がCD163遺伝子に野生型配列を持たないことが明らかになりました。他の7匹の子豚は野生型の配列のみを持っていました。したがって、CRISPR / Cas9システムを体外受精接合子にエレクトロポレーションすることでCD163編集ブタを生成することに成功しましたが、遺伝子改変ブタを高効率で生成するにはさらなる改善が必要です。"]
[29,30368976,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","pancreas duodenum homeobox 1 (PDX-1)","Animal science journal = Nihon chikusan Gakkaiho","Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system  into porcine zygotes via electroporation.",2019,"90(1):55-61","[Tanihara F  et al.]","Tokushima University, Ishii-cho, Tokushima, Japan.",30368976,"10.1111/asj.13129 ","Recently, we established the GEEP (\"gene editing by electroporation of Cas9 protein\") method, in which the CRISPR/Cas9 system, consisting of a Cas9 protein and single guide RNA (sgRNA), is introduced into pig zygotes by electroporation and thus induces highly efficient targeted gene disruption. In this study, we examined the effects of sgRNA on the blastocyst formation of porcine embryos and  evaluated their genome-editing efficiency. To produce an animal model for diabetes, we targeted PDX-1 (pancreas duodenum homeobox 1), a gene that is crucial for pancreas development during the fetal period and whose monoallelic disruption impairs insulin secretion. First, Cas9 protein with different sgRNAs that targeted distinct sites in the PDX-1 exon 1 was introduced into in vitro-fertilized zygotes by the GEEP method. Of the six sgRNAs tested, three sgRNAs (sgRNA1, 2, and 3) successfully modified PDX-1 gene. The blastocyst formation rate of zygotes edited with sgRNA3 was significantly (p < 0.05) lower than that of control zygotes without the electroporation treatment. Our study indicates that the GEEP method can be successfully used to generate PDX-1 mutant  blastocysts, but the development and the efficiency of editing the genome of zygotes may be affected by the sgRNA used for CRISPR/Cas9 system.","pig","最近、Cas9タンパク質とシングルガイドRNA（sgRNA）からなるCRISPR / Cas9システムをエレクトロポレーションによりブタの接合体に導入して誘導するGEEP（「Cas9タンパク質のエレクトロポレーションによる遺伝子編集」）法を確立しました。非常に効率的な標的遺伝子破壊。この研究では、ブタ胚の胚盤胞形成に対するsgRNAの影響を調べ、それらのゲノム編集効率を評価しました。糖尿病の動物モデルを作成するために、胎児期の膵臓の発達に重要であり、単対立遺伝子の破壊がインスリン分泌を損なう遺伝子であるPDX-1（膵臓十二指腸ホメオボックス1）を標的としました。まず、PDX-1エクソン1の異なる部位を標的とする異なるsgRNAを持つCas9タンパク質を、GEEP法によって体外受精した接合子に導入しました。テストした6つのsgRNAのうち、3つのsgRNA（sgRNA1、2、および3）がPDX-1遺伝子の修飾に成功しました。sgRNA3で編集された接合子の胚盤胞形成率は、エレクトロポレーション処理なしの対照接合子のそれよりも有意に（p <0.05）低かった。私たちの研究は、GEEP法を使用してPDX-1変異胚盤胞を生成できることを示していますが、接合子のゲノム編集の開発と効率は、CRISPR / Cas9システムに使用されるsgRNAの影響を受ける可能性があります。"]
[30,31443357,"animal","pig","Cas9;","Porcine endogenous retrovirus (PERV) pol","Animals","The Relationship between Embryonic Development and the Efficiency of Target Mutations in Porcine Endogenous Retroviruses (PERVs) Pol Genes in Porcine Embryos.",2019,"9(9)","[Hirata M et al.]","Tokushima University, Myozai-gun, Tokushima, Japan.",31443357,"10.3390/ani9090593 ","Porcine endogenous retrovirus (PERV) is a provirus found in the pig genome that may act as an infectious pathogen in humans who receive pig organ xenotransplantation. Inactivation of the PERV pol gene in porcine cells reportedly affects cell growth. Therefore, the mutation of PERV pol gene in porcine embryos using genome editing may affect the embryonic development. The present study was carried out to investigate the relationship between the mutation of the PERV pol gene in porcine embryos and their development. We introduced, either alone or in combination, three different gRNAs (gRNA1, 2, and  3) into porcine zygotes by genome editing using electroporation of the Cas9 protein (GEEP) system. All three gRNAs targeted the PERV pol gene, and we assessed their effects on porcine embryonic development. Our results showed that  the blastocyst formation rates of zygotes electroporated with gRNA3-alone and in  combination-were significantly lower (p < 0.05) than those of zygotes electroporated with gRNA1. The mutation rates assessed by the PERV pol gene target site sequencing in individual blastocysts and pooled embryos at the 2-to-8-cell stage did not differ among the three gRNAs. However, the frequency of indel mutations in mutant embryos at the 2-to-8-cell stage trended higher in the  embryos electroporated with gRNA3 alone and in combination. Embryonic development may be affected by gRNAs that induce high-frequency indel mutations.","pig","ブタ内在性レトロウイルス（PERV）は、ブタのゲノムに見られるプロウイルスであり、ブタの臓器異種移植を受けたヒトの感染性病原体として作用する可能性があります。ブタ細胞におけるPERVpol遺伝子の不活性化は、細胞増殖に影響を与えると報告されています。したがって、ゲノム編集を使用したブタ胚のPERV pol遺伝子の変異は、胚発生に影響を与える可能性があります。本研究は、ブタ胚におけるPERVpol遺伝子の変異とその発生との関係を調査するために実施されました。Cas9タンパク質（GEEP）システムのエレクトロポレーションを使用したゲノム編集により、3つの異なるgRNA（gRNA1、2、および3）を単独または組み合わせてブタの接合子に導入しました。3つのgRNAはすべてPERVpol遺伝子を標的とし、ブタの胚発生に対するそれらの影響を評価しました。我々の結果は、gRNA3単独および組み合わせでエレクトロポレーションされた接合子の胚盤胞形成率が、gRNA1でエレクトロポレーションされた接合子の胚盤胞形成率よりも有意に低かった（p <0.05）ことを示した。2〜8細胞期の個々の胚盤胞およびプールされた胚におけるPERV pol遺伝子標的部位配列決定によって評価された突然変異率は、3つのgRNA間で異ならなかった。ただし、2〜8細胞期の変異胚におけるインデル変異の頻度は、gRNA3を単独または組み合わせてエレクトロポレーションした胚で高くなる傾向がありました。胚発生は、高頻度のインデル変異を誘発するgRNAの影響を受ける可能性があります。"]
[31,31862502,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","rsad2","Antiviral research","Generation of pRSAD2 gene knock-in pig via CRISPR/Cas9 technology.",2019,"174:104696","[Xie Z et al.]","Jilin University, Changchun, Jilin, China",31862502,"10.1016/j.antiviral.2019.104696 ","A wide range of endemic and epidemic viruses, including classic swine fever virus (CSFV), pseudorabies virus (PRV) and others, are among the most economically important pathogens in pigs and have severely affected the national economy, human health and animal welfare and productivity. The RSAD2 exhibits antiviral activity against various DNA and RNA viruses. In this study, we successfully accomplished site-specific insertion of the porcine RSAD2 gene (pRSAD2) at the porcine ROSA26 (pROSA26) locus, generating pRSAD2 gene knock-in (pRSAD2-KI) PK-15 cells and porcine foetal fibroblasts (PFFs) via CRISPR/Cas9 technology. Gene expression analysis confirmed that pRSAD2-KI cells stably and efficiently overexpressed the pRSAD2 gene. Furthermore, viral challenge studies in vitro indicated that site-specific integration of the pRSAD2 gene not only effectively  reduced CSFV infection but also PRV infection. More importantly, we ultimately successfully produced a pRSAD2-KI pig that constitutively overexpressed the pRSAD2, viral challenge results indicated that fibroblasts isolated from the pRSAD2-KI pig reduced CSFV infection. Taken together, these results suggest that  CRISPR/Cas9-mediated knock-in strategy can be used for producing pRSAD2-KI pigs.","pig","豚コレラウイルス（CSFV）、仮性狂犬病ウイルス（PRV）などを含む広範囲の風土病および流行性ウイルスは、豚において最も経済的に重要な病原体の1つであり、国民経済、人間の健康、動物の福祉および生産性に深刻な影響を及ぼしています。 。RSAD2は、さまざまなDNAおよびRNAウイルスに対して抗ウイルス活性を示します。この研究では、ブタのROSA26（pROSA26）遺伝子座にブタのRSAD2遺伝子（pRSAD2）を部位特異的に挿入し、pRSAD2遺伝子のノックイン（pRSAD2-KI）PK-15細胞とブタの胎児線維芽細胞（PFF）を生成することに成功しました。 CRISPR / Cas9テクノロジー経由。遺伝子発現解析により、pRSAD2-KI細胞がpRSAD2遺伝子を安定的かつ効率的に過剰発現していることが確認されました。さらに、インビトロでのウイルスチャレンジ研究は、pRSAD2遺伝子の部位特異的統合がCSFV感染だけでなくPRV感染も効果的に減少させることを示した。さらに重要なことに、我々は最終的に、pRSAD2を構成的に過剰発現するpRSAD2-KIブタの生産に成功しました。ウイルスチャレンジの結果は、pRSAD2-KIブタから単離された線維芽細胞がCSFV感染を減少させたことを示しました。まとめると、これらの結果は、CRISPR / Cas9を介したノックイン戦略をpRSAD2-KI豚の生産に使用できることを示唆しています。"]
[32,30859452,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","Rosa26","Applied biochemistry and biotechnology","Establishment of CRISPR/Cas9-Mediated Knock-in System for Porcine Cells with High Efficiency.",2019,"189(1):26-36","[Zhang J et al.]","Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi, China.",30859452,"10.1007/s12010-019-02984-5 ","Since the birth of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9, the new genome engineering technology has become a hot topic in the scientific community. However, for swine, the system of pig cells' homology directed repair (HDR) is generally unstable and costly. Here, we aim to make knock-in of porcine cells more realizable. The Rosa26 locus was chosen for gene editing. Through the optimization of strategy, an efficient sgRNA was selected by TIDE analysis. Correspondingly, a vector system was constructed for gene insertion in pRosa26 locus by homologous recombination. A large percentage of cells whose gene is edited easily result in apoptosis. To improve the positive rate, culturing systems have been optimized. Sequence alignment and nuclear transfer confirmed that we got two knock-in cell lines and transgene primary porcine fetal fibroblasts (PFFs) successfully. Results showed that the gene editing platform we used can obtain genetically modified pig cells stably and efficiently. This system can contribute to pig gene research and production of transgenic pigs.","pig","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9の誕生以来、新しいゲノムエンジニアリング技術は科学界でホットな話題になっています。ただし、ブタの場合、ブタ細胞の相同性指向修復（HDR）のシステムは一般に不安定で、コストがかかります。ここでは、ブタ細胞のノックインをより実現可能にすることを目指しています。Rosa26遺伝子座は遺伝子編集のために選ばれました。戦略の最適化を通じて、効率的なsgRNAがTIDE分析によって選択されました。それに対応して、相同組換えによるpRosa26遺伝子座への遺伝子挿入のためのベクターシステムが構築された。遺伝子が簡単に編集される細胞の大部分はアポトーシスを引き起こします。陽性率を改善するために、培養システムが最適化されています。配列アラインメントと核移植により、2つのノックイン細胞株と導入遺伝子の初代ブタ胎児線維芽細胞（PFF）が正常に得られたことが確認されました。結果は、私たちが使用した遺伝子編集プラットフォームが、遺伝子改変されたブタ細胞を安定的かつ効率的に取得できることを示しました。このシステムは、ブタの遺伝子研究とトランスジェニックブタの生産に貢献することができます。"]
[33,31616930,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (ptgs2)","Biology of reproduction","Ablation of conceptus PTGS2 expression does not alter early conceptus development and establishment of pregnancy in the pigdagger.",2019,null,"[Pfeiffer CA et al.]","University of Missouri, Columbia, MO, USA.",31616930,"10.1093/biolre/ioz192 ","Pig conceptuses secrete estrogens (E2), interleukin 1 beta 2 (IL1B2), and prostaglandins (PG) during the period of rapid trophoblast elongation and establishment of pregnancy. Previous studies established that IL1B2 is essential  for rapid conceptus elongation, whereas E2 is not essential for conceptus elongation or early maintenance of the corpora lutea. The objective of the present study was to determine if conceptus expression of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) and release of PG are important for early development and establishment of pregnancy. To understand the role of PTGS2 in conceptus elongation and pregnancy establishment, a loss-of-function study was conducted by editing PTGS2 using CRISPR/Cas9 technology. Wild-type (PTGS2+/+) and null (PTGS2-/-) fibroblast cells were used to create embryos through somatic cell nuclear transfer. Immunolocalization of PTGS2 and PG production was absent in cultured PTGS2-/- blastocysts on day 7. PTGS2+/+ and PTGS2-/- blastocysts were transferred into surrogate gilts, and the reproductive tracts were collected on either day 14, 17 or 35 of pregnancy. After flushing the uterus on day 14 and 17, filamentous conceptuses were cultured for 3 h to determine PG production. Conceptus release of total PG, PGF2alpha and PGE in culture media was lower with  PTGS2-/- conceptuses compared to PTGS2+/+ conceptuses. However, the total PG, PGF2alpha and PGE content in the uterine flushings was not different. PTGS2-/- conceptus surrogates allowed to continue pregnancy were maintained beyond 30 days of gestation. These results indicate that pig conceptus PTGS2 is not essential for early development and establishment of pregnancy in the pig.","pig","ブタの受胎産物は、急速な栄養膜の伸長と妊娠の確立の期間中に、エストロゲン（E2）、インターロイキン1ベータ2（IL1B2）、およびプロスタグランジン（PG）を分泌します。以前の研究では、IL1B2は急速な受胎産物の伸長に不可欠であるのに対し、E2は受胎産物の伸長や黄体の早期維持には必須ではないことが確認されています。本研究の目的は、プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ2（PTGS2）の受胎産物の発現とPGの放出が、妊娠の早期発症と確立に重要であるかどうかを判断することでした。受胎産物の伸長と妊娠の確立におけるPTGS2の役割を理解するために、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してPTGS2を編集することにより機能喪失研究を実施しました。野生型（PTGS2 + / +）およびヌル（PTGS2-/-）線維芽細胞を使用して、体細胞核移植により胚を作成しました。PTGS2およびPG産生の免疫局在性は、7日目に培養PTGS2-/-胚盤胞では見られなかった。PTGS2+ / +およびPTGS2-/-胚盤胞を代理金箔に移し、妊娠14、17、または35日目に生殖管を採取した。 。14日目と17日目に子宮を紅潮させた後、糸状の受胎産物を3時間培養して、PG産生を測定しました。培養培地中の総PG、PGF2alphaおよびPGEの受胎産物放出は、PTGS2 + / +受胎産物と比較してPTGS2-/-受胎産物で低かった。ただし、子宮洗浄液中のPG、PGF2alpha、およびPGEの合計含有量に違いはありませんでした。妊娠を継続することを許可されたPTGS2-/-受胎産物の代理は、妊娠30日を超えて維持された。これらの結果は、ブタの受胎産物PTGS2がブタの妊娠の初期の発達と確立に必須ではないことを示しています。"]
[34,31066888,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","CYP19A1","Biology of reproduction","New perspective on conceptus estrogens in maternal recognition and pregnancy establishment in the pigdagger.",2019,"101(1):148-161","[Meyer AE et al.]","University of Missouri, Columbia, MO, USA.",31066888,"10.1093/biolre/ioz058 ","The proposed signal for maternal recognition of pregnancy in pigs is estrogen (E2), produced by the elongating conceptuses between days 11 to 12 of pregnancy with a more sustained increase during conceptus attachment and placental development on days 15 to 30. To understand the role of E2 in porcine conceptus elongation and pregnancy establishment, a loss-of-function study was conducted by editing aromatase (CYP19A1) using CRISPR/Cas9 technology. Wild-type (CYP19A1+/+)  and (CYP19A1-/-) fibroblast cells were used to create embryos through somatic cell nuclear transfer, which were transferred into recipient gilts. Elongated and attaching conceptuses were recovered from gilts containing CYP19A1+/+ or CYP19A1-/- embryos on day 14 and 17 of pregnancy. Total E2 in the uterine flushings of gilts with CYP19A1-/- embryos was lower than recipients containing CYP19A1+/+ embryos with no difference in testosterone, PGF2alpha, or PGE2 on either day 14 or 17. Despite the loss of conceptus E2 production, CYP19A1-/- conceptuses were capable of maintaining the corpora lutea. However, gilts gestating CYP19A1-/- embryos aborted between days 27 and 31 of gestation. Attempts to rescue the pregnancy of CYP19A1-/- gestating gilts with exogenous E2  failed to maintain pregnancy. However, CYP19A1-/- embryos could be rescued when co-transferred with embryos derived by in vitro fertilization. Endometrial transcriptome analysis revealed that ablation of conceptus E2 resulted in disruption of a number biological pathways. Results demonstrate that intrinsic E2 conceptus production is not essential for pre-implantation development, conceptus elongation, and early CL maintenance, but is essential for maintenance of pregnancy beyond 30 days .","pig","ブタの妊娠を母体が認識するために提案されたシグナルはエストロゲン（E2）であり、妊娠11日から12日の間に受胎産物が伸長し、15日から30日の受胎産物の付着と胎盤の発達の間にさらに持続的に増加します。ブタの受胎産物の伸長と妊娠の確立におけるE2では、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してアロマターゼ（CYP19A1）を編集することにより、機能喪失研究が実施されました。野生型（CYP19A1 + / +）および（CYP19A1-/-）線維芽細胞を使用して、体細胞核移植により胚を作成し、これをレシピエントの雌ブタに移植しました。妊娠14日目と17日目に、CYP19A1 + / +またはCYP19A1-/-胚を含む雌ブタから伸長した付着性受胎産物を回収しました。CYP19A1-/-胚による雌ブタの子宮フラッシングにおける総E2は、CYP19A1 + / +胚を含むレシピエントよりも低く、14日目または17日目にテストステロン、PGF2alpha、またはPGE2に差はありませんでした。受胎産物E2産生の喪失にもかかわらず、CYP19A1- / -conceptusesはcorporaluteaを維持することができました。しかし、CYP19A1-/-胚を妊娠している雌ブタは、妊娠27日から31日までの間に流産しました。CYP19A1-/-外因性E2で妊娠中の雌ブタの妊娠を救う試みは妊娠を維持できませんでした。ただし、CYP19A1-/-胚は、体外受精によって得られた胚と同時移植された場合に救出される可能性があります。子宮内膜トランスクリプトーム解析により、受胎産物E2の除去が多くの生物学的経路の破壊をもたらすことが明らかになりました。結果は、内因性E2受胎産物の産生は、着床前の発達、受胎産物の伸長、および早期のCL維持には必須ではないが、30日を超える妊娠の維持には不可欠であることを示しています。"]
[35,30941371,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","ribonuclease L","BioMed research international","CRISPR-Cas9 Mediated RNase L Knockout Regulates Cellular Function of PK-15 Cells  and Increases PRV Replication.",2019,"2019:7398208","[Sui C  et al.]","Shandong Agricultural University, Tai'an, China.",30941371,"10.1155/2019/7398208 ","Ribonuclease L (RNase L) is an important antiviral endoribonuclease regulated by  type I IFN. RNase L is activated by viral infection and dsRNA. Because the role of swine RNase L (sRNase L) is not fully understood, in this study, we generated  a sRNase L knockout PK-15 (KO-PK) cell line through the CRISPR/Cas9 gene editing  system to evaluate the function of sRNase L. After transfection with CRISPR-Cas9  followed by selection using puromycin, sRNase L knockout in PK-15 cells was further validated by agarose gel electrophoresis, DNA sequencing, and Western blotting. The sRNase L KO-PK cells failed to trigger RNA degradation and induced  less apoptosis than the parental PK-15 cells after transfected with poly (I: C).  Furthermore, the levels of ISGs mRNA in sRNase L KO-PK cells were higher than those in the parental PK-15 cells after treated with poly (I: C). Finally, both wild type and attenuated pseudorabies viruses (PRV) replicated more efficiently in sRNase L KO-PK cells than the parental PK-15 cells. Taken together, these findings suggest that sRNase L has multiple biological functions including cellular single-stranded RNA degradation, induction of apoptosis, downregulation  of transcript levels of ISGs, and antiviral activity against PRV. The sRNase L KO-PK cell line will be a valuable tool for studying functions of sRNase L as well as for producing PRV attenuated vaccine.","pig","リボヌクレアーゼL（RNase L）は、I型IFNによって調節される重要な抗ウイルス性エンドリボヌクレアーゼです。RNase Lは、ウイルス感染とdsRNAによって活性化されます。ブタRNaseL（sRNase L）の役割が完全には理解されていないため、この研究では、CRISPR / Cas9遺伝子編集システムを介してsRNaseLノックアウトPK-15（KO-PK）細胞株を生成し、sRNaseの機能を評価しました。 L. CRISPR-Cas9でトランスフェクションした後、プロマイシンを使用して選択した後、PK-15細胞でのsRNase Lノックアウトを、アガロースゲル電気泳動、DNAシーケンス、およびウエスタンブロッティングによってさらに検証しました。sRNase L KO-PK細胞は、RNA分解を引き起こすことができず、ポリでトランスフェクトした後、親PK-15細胞よりもアポトーシスを誘導しませんでした（I：C）。さらに、sRNase LKO-PK細胞のISGsmRNAのレベルは、ポリで処理した後の親PK-15細胞のレベルよりも高かった（I：C）。最後に、野生型と弱毒化仮性狂犬病ウイルス（PRV）の両方が、親PK-15細胞よりもsRNase LKO-PK細胞でより効率的に複製されました。まとめると、これらの発見は、sRNase Lが、細胞の一本鎖RNA分解、アポトーシスの誘導、ISGの転写レベルのダウンレギュレーション、PRVに対する抗ウイルス活性などの複数の生物学的機能を持っていることを示唆しています。sRNase L KO-PK細胞株は、sRNase Lの機能を研究するため、およびPRV弱毒化ワクチンを製造するための貴重なツールになります。"]
[36,31371630,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","Mx2; beta 1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase","Bioscience reports","Porcine antiviral activity is increased by CRISPRa-SAM system.",2019,"39(8)","[Jiang J et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, China.",31371630,"10.1042/BSR20191496 ","Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat activation-synergistic activation mediator system (CRISPRa-SAM) has been efficiently used to up-regulate the targeted genes in human and mouse. But it is not known whether the CRISPRa-SAM system can be used against porcine disease because its two important  transcriptional activation domains (P65 and heat shock transcription factor 1 (HSF1)) are from mouse and human, respectively. Pig is one of the most important  meat sources, porcine viral infectious diseases cause massive economic losses to  the swine industry and threaten the public health. We aimed to investigate whether the CRISPRa-SAM system could increase porcine antiviral activity by mediating two pig-specific target genes (Mx2 and beta1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase (B4galnt2)). First, we constructed PK-15 and IPEC-J2 cell lines expressing nuclease-deficient Cas9 (dCas9)-vp64 and MS2-P65-HSF1 stably. Next, in these two cell models, we activated Mx2 and B4galnt2 expression through CRISPRa-SAM system. Antiviral activity to PRV or H9N2 was improved in PK-15 cells where Mx2 or B4galnt2 was activated. Altogether, our  results demonstrated the potential of CRISPRa-SAM system as a powerful tool for activating pig genes and improving porcine antiviral activity.","pig","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート活性化-相乗的活性化メディエーターシステム（CRISPRa-SAM）は、ヒトとマウスの標的遺伝子をアップレギュレートするために効率的に使用されています。しかし、CRISPRa-SAMシステムがブタの病気に対して使用できるかどうかは不明です。その2つの重要な転写活性化ドメイン（P65と熱ショック転写因子1（HSF1））は、それぞれマウスとヒトに由来するからです。豚は最も重要な食肉源の1つであり、豚のウイルス感染症は豚産業に多大な経済的損失をもたらし、公衆衛生を脅かしています。CRISPRa-SAMシステムが2つのブタ特異的標的遺伝子（Mx2およびbeta1,4 N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（B4galnt2））を媒介することにより、ブタの抗ウイルス活性を高めることができるかどうかを調査することを目的としました。まず、ヌクレアーゼ欠損Cas9（dCas9）-vp64およびMS2-P65-HSF1を安定して発現するPK-15およびIPEC-J2細胞株を構築しました。次に、これら2つの細胞モデルで、CRISPRa-SAMシステムを介してMx2とB4galnt2の発現を活性化しました。PRVまたはH9N2に対する抗ウイルス活性は、Mx2またはB4galnt2が活性化されたPK-15細胞で改善されました。全体として、我々の結果は、ブタの遺伝子を活性化し、ブタの抗ウイルス活性を改善するための強力なツールとしてのCRISPRa-SAMシステムの可能性を実証しました。"]
[37,31060546,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","RAG2; IL2RG; SCD5; Ig Heavy chain","BMC biotechnology","Frequency of off-targeting in genome edited pigs produced via direct injection of the CRISPR/Cas9 system into developing embryos.",2019,"19(1):25","[Carey K et al.]","Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA.",31060546,"10.1186/s12896-019-0517-7 ","BACKGROUND: The CRISPR/Cas9 system can effectively introduce site-specific modifications to the genome. The efficiency is high enough to induce targeted genome modifications during embryogenesis, thus increasing the efficiency of producing genetically modified animal models and having potential clinical applications as an assisted reproductive technology. Because most of the CRISPR/Cas9 systems introduce site-specific double-stranded breaks (DSBs) to induce site-specific modifications, a major concern is its potential off-targeting activity, which may hinder the application of the technology in clinics. In this study, we investigated off-targeting events in genome edited pigs/fetuses that were generated through direct injection of the CRISPR/Cas9 system into developing embryos; off-targeting activity of four different sgRNAs targeting RAG2, IL2RG, SCD5, and Ig Heavy chain were examined. RESULTS: First, bioinformatics analysis was applied to identify 27 potential off-targeting genes  from the sgRNAs. Then, PCR amplification followed by sequencing analysis was used to verify the presence of off-targeting events. Off-targeting events were only identified from the sgRNA used to disrupt Ig Heavy chain in pigs; frequency of off-targeting was 80 and 70% on AR and RBFOX1 locus respectively. A potential PAM sequence was present in both of the off-targeting genes adjacent to probable sgRNA binding sites. Mismatches against sgRNA were present only on the 5' side of AR, suggesting that off-targeting activities are systematic events. However, the  mismatches on RBFOX1 were not limited to the 5' side, indicating unpredictability of the events. CONCLUSIONS: The prevalence of off-targeting is low via direct injection of CRISPR/Cas9 system into developing embryos, but the events cannot be accurately predicted. Off-targeting frequency of each CRISPR/Cas9 system should be deliberately assessed prior to its application in clinics.","pig","背景：CRISPR / Cas9システムは、ゲノムに部位特異的な修飾を効果的に導入することができます。効率は、胚発生中に標的ゲノム修飾を誘発するのに十分高いため、遺伝子改変動物モデルの作成効率が向上し、生殖補助医療としての潜在的な臨床応用が可能になります。ほとんどのCRISPR / Cas9システムはサイト固有の二本鎖切断（DSB）を導入してサイト固有の変更を誘発するため、主な懸念はその潜在的なオフターゲティング活動であり、診療所でのテクノロジーの適用を妨げる可能性があります。この研究では、発生中の胚へのCRISPR / Cas9システムの直接注入によって生成されたゲノム編集されたブタ/胎児のオフターゲティングイベントを調査しました。RAG2、IL2RG、SCD5、およびIg重鎖を標的とする4つの異なるsgRNAのオフターゲティング活性を調べました。結果：最初に、バイオインフォマティクス分析を適用して、sgRNAから27の潜在的なオフターゲティング遺伝子を特定しました。次に、PCR増幅とそれに続くシーケンシング分析を使用して、オフターゲティングイベントの存在を確認しました。オフターゲティングイベントは、ブタのIg重鎖を破壊するために使用されるsgRNAからのみ特定されました。オフターゲティングの頻度は、ARおよびRBFOX1遺伝子座でそれぞれ80％および70％でした。潜在的なPAM配列は、おそらくsgRNA結合部位に隣接する両方のオフターゲティング遺伝子に存在していました。sgRNAに対するミスマッチは、ARの5 '側にのみ存在し、オフターゲティング活動が体系的なイベントであることを示唆しています。ただし、RBFOX1の不一致は5 '側に限定されておらず、イベントの予測不可能性を示しています。結論：CRISPR / Cas9システムを発生中の胚に直接注入することにより、オフターゲティングの有病率は低くなりますが、イベントを正確に予測することはできません。各CRISPR / Cas9システムのオフターゲット頻度は、診療所に適用する前に慎重に評価する必要があります。"]
[38,31659151,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","islet amyloid polypeptide","Cell death & disease","Preparation of a new type 2 diabetic miniature pig model via the CRISPR/Cas9 system.",2019,"10(11):823","[Zou X et al.]","Jilin University, Changchun, Jilin, China.",31659151,"10.1038/s41419-019-2056-5 ","Diabetes has become one of the major noninfectious diseases that seriously endanger public health. The formation of islet amyloid polypeptide (IAPP) affects the normal physiological functions of the body, such as glucose metabolism and lipid metabolism. The mature human IAPP protein (hIAPP) has a strong tendency to  misfold and is considered to be one of the major causes of amyloid changes in islets. Deposition of hIAPP is considered to be one of the leading causes of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Miniature pigs are experimental animal models that are well suited for research on gene function and human diabetes. In our study, we obtained IAPP gene-humanized miniature pigs via the CRISPR/Cas9 system and somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology. The hIAPP pigs can be used to further study the pathogenesis and related complications of T2DM and to lay a solid foundation for the prevention and treatment of T2DM.","pig","糖尿病は、公衆衛生を深刻に危険にさらす主要な非感染性疾患の1つになっています。膵島アミロイドポリペプチド（IAPP）の形成は、グルコース代謝や脂質代謝など、身体の正常な生理学的機能に影響を与えます。成熟したヒトIAPPタンパク質（hIAPP）は誤って折りたたまれる傾向が強く、膵島のアミロイド変化の主な原因の1つであると考えられています。hIAPPの沈着は、2型糖尿病（T2DM）の主要な原因の1つであると考えられています。ミニブタは、遺伝子機能やヒトの糖尿病の研究に適した実験動物モデルです。私たちの研究では、CRISPR / Cas9システムと体細胞核移植（SCNT）技術を介してIAPP遺伝子でヒト化されたミニブタを入手しました。hIAPP豚は、T2DMの病因と関連する合併症をさらに研究し、T2DMの予防と治療のための確固たる基盤を築くために使用できます。"]
[39,30717310,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","miR-17-92 cluster","Cells","CRISPR/Cas9-Mediated Hitchhike Expression of Functional shRNAs at the Porcine miR-17-92 Cluster.",2019,"8(2)","[Lu C  et al.]","Jilin University, Changchun, China.",30717310,"10.3390/cells8020113 ","Successful RNAi applications depend on strategies allowing stable and persistent  expression of minimal gene silencing triggers without perturbing endogenous gene  expression. In this study, we proposed an endogenous microRNA (miRNA) cluster as  a novel integration site for small hairpin RNAs (shRNAs). We successfully integrated exogenous shRNAs at the porcine miRNA-17-92 (pmiR-17-92) cluster via a CRISPR/Cas9-mediated knock-in strategy. The anti-EGFP or anti-CSFV shRNAs could be stably and effectively expressed at the control of the endogenous promoter of  the pmiR-17-92 cluster. Importantly, we confirmed that hitchhike expression of anti- classical swine fever (CSFV) shRNA had no effect on cell growth, blastocyst development and endogenous pmiR-17-92 expression in selected transgene (TG) porcine fetal fibroblasts (PFFs) clones. Moreover, these TG PFFs could inhibit the replication of CSFV by half and could be further used for generation of transgenic pigs. Taken together, these results show that our RNA interference (RNAi) expression strategy benefits numerous applications, from miRNA, genome and transgenic research, to gene therapy.","pig","RNAiアプリケーションの成功は、内因性遺伝子発現を乱すことなく、最小限の遺伝子サイレンシングトリガーの安定した持続的な発現を可能にする戦略に依存しています。この研究では、小さなヘアピンRNA（shRNA）の新しい統合サイトとして内因性マイクロRNA（miRNA）クラスターを提案しました。CRISPR / Cas9を介したノックイン戦略を介して、ブタmiRNA-17-92（pmiR-17-92）クラスターに外因性shRNAを統合することに成功しました。抗EGFPまたは抗CSFVshRNAは、pmiR-17-92クラスターの内因性プロモーターの制御下で安定的かつ効果的に発現させることができます。重要なのは、抗豚コレラ（CSFV）shRNAのヒッチハイク発現が、選択した導入遺伝子（TG）ブタ胎児線維芽細胞（PFF）クローンにおける細胞増殖、胚盤胞発生、および内因性pmiR-17-92発現に影響を及ぼさないことを確認したことです。さらに、これらのTG PFFは、CSFVの複製を半分に阻害する可能性があり、トランスジェニックブタの作製にさらに使用することができます。まとめると、これらの結果は、RNA干渉（RNAi）発現戦略が、miRNA、ゲノム、トランスジェニック研究から遺伝子治療まで、多くのアプリケーションに役立つことを示しています。"]
[40,30762444,"animal","pig","CRISPR;Cas9","fumarylacetoacetate hydrolase (Fah); Recombinant activation gene 2 (Rag2)","DNA and cell biology","Efficient Generation of an Fah/Rag2 Dual-Gene Knockout Porcine Cell Line Using CRISPR/Cas9 and Adenovirus.",2019,"38(4):314-321","[Gao M et al.]","Sichuan University, Chengdu, China.",30762444,"10.1089/dna.2018.4493 ","The shortage of human hepatocytes continues to be a significant limitation for the widespread application of hepatocyte transplantation and bioartificial liver  (BAL) support therapy. Recombinant activation gene 2 (Rag2) and fumarylacetoacetate hydrolase (Fah)-deficient mice could be highly repopulated with human hepatocytes. However, Fah/Rag2-deficient mice can only produce up to 1 x 10(8) human hepatocytes per mouse. We hypothesized that 2-10 x 10(10) human hepatocytes can be produced per Fah/Rag2-deficient pig, which is an adequate supply for hepatocyte transplantation and BAL therapy. In a novel approach, we used stably transfected Cas9 cells and single-guide RNA adenoviruses containing fluorescent reporters to enrich porcine cells with Fah/Rag2 dual gene mutations.  This resulted in the construction of Fah/Rag2 double knockout porcine iliac artery endothelial cells, which were subsequently used for generating Fah/Rag2-deficient pigs.","pig","ヒト肝細胞の不足は、肝細胞移植およびバイオ人工肝臓（BAL）サポート療法の広範な適用のための重要な制限であり続けています。組換え活性化遺伝子2（Rag2）およびフマリルアセトアセタートヒドロラーゼ（Fah）欠損マウスは、ヒト肝細胞で高度に再増殖する可能性があります。ただし、Fah / Rag2欠損マウスは、マウス1匹あたり最大1 x 10（8）のヒト肝細胞しか産生できません。2-10 x 10（10）のヒト肝細胞は、肝細胞移植とBAL療法に十分な供給量であるFah / Rag2欠損ブタ1頭あたりに産生できると仮定しました。新しいアプローチでは、安定的にトランスフェクトされたCas9細胞と蛍光レポーターを含むシングルガイドRNAアデノウイルスを使用して、Fah / Rag2二重遺伝子変異でブタ細胞を濃縮しました。これにより、Fah / Rag2ダブルノックアウトブタ腸骨動脈内皮細胞が構築され、その後、Fah / Rag2欠損ブタの作製に使用されました。"]
[41,31308290,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","hairless","Experimental animals","Hairless-knockout piglets generated using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated-9 exhibit abnormalities in the skin and thymus.",2019,"68(4):519-529","[Gao QS et al.]","Yanbian University, Yanji, Jilin, China.",31308290,"10.1538/expanim.19-0018 ","The nuclear receptor corepressor Hairless (HR) interacts with nuclear receptors and controls expression of specific target genes involved in hair morphogenesis and hair follicle cycling. Patients with HR gene mutations exhibit atrichia, and  in rare cases, immunodeficiency. Pigs with HR gene mutations may provide a useful model for developing therapeutic strategies because pigs are highly similar to humans in terms of anatomy, genetics, and physiology. The present study aimed to  knockout the HR gene in pigs using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated-9 (Cas9) system and to investigate  the molecular and structural alterations in the skin and thymus. We introduced a  biallelic mutation into the HR gene in porcine fetal fibroblasts and generated nine piglets via somatic cell nuclear transfer. These piglets exhibited a lack of hair on the eyelids, abnormalities in the thymus and peripheral blood, and altered expression of several signaling factors regulated by HR. Our results indicate that introduction of the biallelic mutation successfully knocked out the HR gene, resulting in several molecular and structural changes in the skin and thymus. These pigs will provide a useful model for studying human hair disorders  associated with HR gene mutations and the underlying molecular mechanisms.","pig","核内受容体コリプレッサーHairless（HR）は核内受容体と相互作用し、毛髪の形態形成と毛包の循環に関与する特定の標的遺伝子の発現を制御します。HR遺伝子変異を有する患者は、無痛症を示し、まれに免疫不全を示します。豚は解剖学、遺伝学、生理学の点で人間と非常に似ているため、HR遺伝子変異を持つ豚は治療戦略を開発するための有用なモデルを提供する可能性があります。本研究は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連-9（Cas9）システムを使用してブタのHR遺伝子をノックアウトし、皮膚と胸腺の分子的および構造的変化を調査することを目的とした。ブタ胎児線維芽細胞のHR遺伝子に二対立遺伝子変異を導入し、体細胞核移植を介して9匹の子豚を生成しました。これらの子豚は、まぶたの毛の欠如、胸腺と末梢血の異常、およびHRによって調節されるいくつかのシグナル伝達因子の発現の変化を示しました。我々の結果は、二対立遺伝子変異の導入がHR遺伝子のノックアウトに成功し、皮膚と胸腺にいくつかの分子的および構造的変化をもたらしたことを示しています。これらのブタは、HR遺伝子変異とその根底にある分子メカニズムに関連するヒトの毛髪障害を研究するための有用なモデルを提供します。"]
[42,31057603,"animal","pig","Cas9;","IGF2","Frontiers in genetics","sgRNA-shRNA Structure Mediated SNP Site Editing on Porcine IGF2 Gene by CRISPR/StCas9.",2019,"10:347","[Sun Y et al.]","Northwest A&F University, Yangling, China.",31057603,"10.3389/fgene.2019.00347 ","The SNP within intron 3 of the porcine IGF2 gene (G3072A) plays an important role for muscle growth and fat deposition in pigs. In this study, the StCas9 derived from Streptococcus thermophilus together with the Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure were combined to boost the G to A base editing on the IGF2 SNP site, which we called \"SNP editing.\" The codon-humanized StCas9 as we previously reported was firstly compared with the prevalently used SpCas9 derived from Streptococcus pyogenes using our idiomatic surrogate report assay, and the StCas9 demonstrated a comparable targeting activity. On the other hand, by combining shRNA with sgRNA, simultaneous gene silencing and genome targeting can be achieved. Thus, the novel IGF2.sgRNA-LIG4.shRNA-IGF2.sgRNA structure was constructed to enhance the sgRNA/Cas9-mediated HDR-based IGF2 SNP editing by silencing the LIG4 gene, which is a key molecule of the HDR's competitive NHEJ pathway. The sgRNA-shRNA/StCas9 all-in-one expression vector and the IGF2.sgRNA/StCas9 as control were separately used to transfect porcine PK15 cells together with an ssODNs donor for the IGF2 SNP editing. The editing events were detected by the RFLP assay, Sanger sequencing as well as Deep-sequencing, and the Deep-sequencing results finally demonstrated a significant higher HDR-based editing efficiency (16.38%) for our sgRNA-shRNA/StCas9 strategy. In short, we achieved effective IGF2 SNP editing by using the combined sgRNA-shRNA/StCas9 strategy, which will facilitate the further production of base-edited animals and perhaps extend for the gene therapy for the base correction of some genetic diseases.","pig","ブタIGF2遺伝子（G3072A）のイントロン3内のSNPは、ブタの筋肉成長と脂肪沈着に重要な役割を果たします。この研究では、Streptococcus thermophilusに由来するStCas9とDroshaを介したsgRNA-shRNA構造を組み合わせて、IGF2SNPサイトでのGからAへの塩基編集を促進しました。これを「SNP編集」と呼びます。以前に報告したコドンヒト化StCas9は、慣用的な代理レポートアッセイを使用して、Streptococcus pyogenesに由来する一般的に使用されているSpCas9と最初に比較され、StCas9は同等のターゲティング活性を示しました。一方、shRNAとsgRNAを組み合わせることで、遺伝子サイレンシングとゲノムターゲティングを同時に行うことができます。したがって、新しいIGF2.sgRNA-LIG4.shRNA-IGF2.sgRNA構造は、HDRの競合NHEJ経路の重要な分子であるLIG4遺伝子をサイレンシングすることにより、sgRNA / Cas9を介したHDRベースのIGF2SNP編集を強化するために構築されました。sgRNA-shRNA / StCas9オールインワン発現ベクターとコントロールとしてのIGF2.sgRNA / StCas9を別々に使用して、IGF2SNP編集用のssODNドナーと一緒にブタPK15細胞をトランスフェクトしました。編集イベントは、RFLPアッセイ、サンガーシーケンシング、およびディープシーケンシングによって検出され、ディープシーケンシングの結果は、sgRNA-shRNA / StCas9戦略でHDRベースの編集効率が大幅に高い（16.38％）ことを最終的に示しました。要するに、sgRNA-shRNA / StCas9を組み合わせた戦略を使用することで、効果的なIGF2 SNP編集を実現しました。これにより、塩基編集動物のさらなる生産が容易になり、一部の遺伝病の塩基矯正のための遺伝子治療が拡張される可能性があります。"]
[43,31921118,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","integrin beta5 subunit (ITGB5)","Frontiers in immunology","ITGB5 Plays a Key Role in Escherichia coli F4ac-Induced Diarrhea in Piglets.",2019,"10:2834","[Wang W et al.]","Shandong Agricultural University, Tai'an, China.",31921118,"10.3389/fimmu.2019.02834 ","Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) that expresses F4ac fimbriae is the major pathogenic microorganism responsible for bacterial diarrhea in neonatal piglets.  The susceptibility of piglets to ETEC F4ac is determined by a specific receptor on the small intestinal epithelium surface. We performed an iTRAQ-labeled quantitative proteome analysis using a case-control design in which susceptible and resistant full-sib piglets were compared for the protein expression levels. Two thousand two hundred forty-nine proteins were identified, of which 245 were differentially expressed (fold change > 1.5, FDR-adjusted P < 0.05). The differentially expressed proteins fell into four functional classes: (I) cellular adhesion and binding, (II) metabolic process, (III) apoptosis and proliferation,  and (IV) immune response. The integrin signaling pathway merited particular interest based on a pathway analysis using statistical overexpression and enrichment tests. Genomic locations of the integrin family genes were determined  based on the most recent porcine genome sequence assembly (Sscrofa11.1). Only one gene, ITGB5, which encodes the integrin beta5 subunit that assorts with the alphav subunit to generate integrin alphavbeta5, was located within the SSC13q41  region between 13:133161078 and 13:139609422, where strong associations of markers with the ETEC F4ac susceptibility were found in our previous GWAS results. To identify whether integrin alphavbeta5 is the ETEC F4acR, we established an experimental model for bacterial adhesion using IPEC-J2 cells. Then, the ITGB5 gene was knocked out in IPEC-J2 cell lines using CRISPR/Cas9, resulting in a biallelic deletion cell line (ITGB5 (-/-)). Disruption of ITGB5 significantly reduced ETEC F4ac adhesion to porcine intestinal epithelial cells.  In contrast, overexpression of ITGB5 significantly enhanced the adhesion. A GST pull-down assay with purified FaeG and ITGB5 also showed that FaeG binds directly to ITGB5. Together, the results suggested that ITGB5 is a key factor affecting the susceptibility of piglets to ETEC F4ac.","pig","F4ac線毛を発現する腸管毒素原性大腸菌（ETEC）は、新生子豚の下痢の原因となる主要な病原性微生物です。ETEC F4acに対する子豚の感受性は、小腸上皮表面の特定の受容体によって決定されます。感受性と耐性の全きょうだい子豚のタンパク質発現レベルを比較したケースコントロールデザインを使用して、iTRAQ標識定量的プロテオーム解析を実施しました。224個のタンパク質が同定され、そのうち245個が差次的に発現しました（倍率変化> 1.5、FDR調整済みP <0.05）。差次的に発現するタンパク質は、（I）細胞接着と結合、（II）代謝プロセス、（III）アポトーシスと増殖、（IV）免疫応答の4つの機能クラスに分類されました。インテグリンシグナル伝達経路は、統計的過剰発現および濃縮試験を使用した経路分析に基づいて、特に関心を集めました。インテグリンファミリー遺伝子のゲノム位置は、最新のブタゲノム配列アセンブリ（Sscrofa11.1）に基づいて決定されました。インテグリンalphavbeta5を生成するためにalphavサブユニットと分類するインテグリンbeta5サブユニットをコードする唯一の遺伝子ITGB5は、13：133161078と13：139609422の間のSSC13q41領域内にあり、マーカーとETECF4ac感受性との強い関連が見られました。以前のGWASの結果で。インテグリンalphavbeta5がETECF4acRであるかどうかを識別するために、IPEC-J2細胞を使用した細菌付着の実験モデルを確立しました。次に、CRISPR / Cas9を使用してIPEC-J2細胞株でITGB5遺伝子をノックアウトし、2対立遺伝子の欠失細胞株（ITGB5（-/-））を作成しました。ITGB5の破壊は、ブタ腸上皮細胞へのETECF4acの接着を大幅に減少させました。対照的に、ITGB5の過剰発現は接着を大幅に強化しました。精製されたFaeGとITGB5を使用したGSTプルダウンアッセイでも、FaeGがITGB5に直接結合することが示されました。総合すると、結果は、ITGB5が子豚のETECF4acに対する感受性に影響を与える重要な要因であることを示唆しました。"]
[44,31818875,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","cep112","G3","CRISPR/Cas9-Mediated Integration of Large Transgene into Pig CEP112 Locus.",2019,null,"[Li G et al.]","South China Agricultural University, China.",31818875,"10.1534/g3.119.400810 ","Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) is a precise genome manipulating tool that can produce targeted  gene mutations in various cells and organisms. Although CRISPR/Cas9 can efficiently generate gene knockout, the gene knock-in (KI) efficiency mediated by homology-directed repair remains low, especially for large fragment integration.  In this study, we established an efficient method for the CRISPR/Cas9-mediated integration of large transgene cassette, which carries salivary gland-expressed multiple digestion enzymes ( approximately 20 kbp) in CEP112 locus in pig fetal fibroblasts (PFFs). Our results showed that using an optimal homology donor with  a short and a long arm yielded the best CRISPR/Cas9-mediated KI efficiency in CEP112 locus, and the targeting efficiency in CEP112 locus was higher than in ROSA26 locus. The CEP112 KI cell lines were used as nuclear donors for somatic cell nuclear transfer to create genetically modified pigs. We found that KI pig (705) successfully expressed three microbial enzymes (beta-glucanase, xylanase, and phytase) in salivary gland. This finding suggested that the CEP112 locus supports exogenous gene expression by a tissue-specific promoter. In summary, we  successfully targeted CEP112 locus in pigs by using our optimal homology arm system and established a modified pig model for foreign digestion enzyme expression in the saliva.","pig","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）関連タンパク質9（Cas9）は、さまざまな細胞や生物に標的遺伝子変異を生成できる正確なゲノム操作ツールです。CRISPR / Cas9は遺伝子ノックアウトを効率的に生成できますが、相同性指向修復によって媒介される遺伝子ノックイン（KI）効率は、特に大きなフラグメントの統合では低いままです。この研究では、ブタ胎児線維芽細胞（PFF）のCEP112遺伝子座に唾液腺で発現する複数の消化酵素（約20 kbp）を運ぶ大きな導入遺伝子カセットをCRISPR / Cas9を介して統合するための効率的な方法を確立しました。私たちの結果は、短いアームと長いアームを持つ最適な相同性ドナーを使用すると、CEP112遺伝子座で最高のCRISPR / Cas9を介したKI効率が得られ、CEP112遺伝子座でのターゲティング効率がROSA26遺伝子座よりも高いことを示しました。CEP112 KI細胞株は、遺伝子改変されたブタを作成するための体細胞核移植の核ドナーとして使用されました。KI pig（705）は、唾液腺で3つの微生物酵素（ベータグルカナーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ）を正常に発現することがわかりました。この発見は、CEP112遺伝子座が組織特異的プロモーターによる外因性遺伝子発現をサポートしていることを示唆しました。要約すると、最適な相同性アームシステムを使用して、ブタのCEP112遺伝子座をターゲットにすることに成功し、唾液中の外来消化酵素発現の修正ブタモデルを確立しました。"]
[45,31470649,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH)","Genes","Identification of Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase Gene as an Alternative Safe Harbor Locus in Pig Genome.",2019,"10(9)","[Han X  et al.]","Breeding and Reproduction (Huazhong Agricultural University), Ministry of Education, Wuhan, China.",31470649,"10.3390/genes10090660 ","The ectopic overexpression of foreign genes in animal genomes is an important strategy for gain-of-function study and establishment of transgenic animal models. Previous studies showed that two loci (Rosa26 and pH11) were identified as safe harbor locus in pig genomes, which means foreign genes can be integrated  into this locus for stable expression. Moreover, integration of a transgene may interfere with the endogenous gene expression of the target locus after the foreign fragments are inserted. Here, we provide a new strategy for efficient transgene knock-in in the endogenous GAPDH gene via CRISPR/Cas9 mediated homologous recombination. This strategy has no influence on the expression of the endogenous GAPDH gene. Thus, the GAPDH locus is a new alternative safe harbor locus in the pig genome for foreign gene knock-ins. This strategy is promising for agricultural breeding and biomedical model applications.","pig","動物ゲノムにおける外来遺伝子の異所性過剰発現は、機能獲得研究およびトランスジェニック動物モデルの確立のための重要な戦略です。以前の研究では、2つの遺伝子座（Rosa26とpH11）がブタゲノムのセーフハーバー遺伝子座として特定されたことが示されました。これは、安定した発現のために外来遺伝子をこの遺伝子座に組み込むことができることを意味します。さらに、導入遺伝子の組み込みは、外来フラグメントが挿入された後の標的遺伝子座の内因性遺伝子発現を妨害する可能性がある。ここでは、CRISPR / Cas9を介した相同組換えを介して内因性GAPDH遺伝子に効率的な導入遺伝子ノックインを行うための新しい戦略を提供します。この戦略は、内因性GAPDH遺伝子の発現に影響を与えません。したがって、GAPDH遺伝子座は、外来遺伝子ノックインのブタゲノムにおける新しい代替セーフハーバー遺伝子座です。この戦略は、農業育種および生物医学モデルのアプリケーションに有望です。"]
[46,31099266,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","cystic fibrosis transmembrane conductance regulator","Human gene therapy","In Vitro Validation of a CRISPR-Mediated CFTR Correction Strategy for Preclinical Translation in Pigs.",2019,"30(9):1101-1116","[Zhou ZP et al.]","University of Toronto, Toronto, Canada.",31099266,"10.1089/hum.2019.074 ","Early efforts in cystic fibrosis (CF) gene therapy faced major challenges in delivery efficiency and sustained therapeutic gene expression. Recent advancements in engineered site-specific endonucleases such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 make permanent CF transmembrane conductance regulator (CFTR) gene correction possible. However, because of safety concerns of the CRISPR/Cas9 system and challenges in in vivo delivery to inflamed CF airway, CRISPR-based gene correction strategies need to be tested in proper animal models. In this study, we aimed at creating vectors for testing CFTR gene correction in pig models. We constructed helper-dependent adenoviral (HD-Ad) vectors to deliver CRISPR/Cas9 and a donor template (a 6 kb LacZ or 8.7 kb human CFTR expression cassette) into cultured pig cells. We demonstrated precise integration of each donor into the GGTA1 safe harbor through Cas9-induced homology directed repair with 3 kb homology arms. In addition, we showed that both LacZ and hCFTR were persistently expressed in transduced cells.  Furthermore, we created a CFTR-deficient cell line for testing CFTR correction. We detected hCFTR mRNA and protein expression in cells transduced with the hCFTR  vector. We also demonstrated CFTR function in the CF cells transduced with the HD-Ad delivering the CRISPR-Cas9 system and hCFTR donor at late cellular passages using the membrane potential sensitive dye-based assay (FLIPR((R))). Combined with our previous report on gene delivery to pig airway basal cells, these data provide the feasibility of testing CRISPR/Cas9-mediated permanent human CFTR correction through HD-Ad vector delivery in pigs.","pig","嚢胞性線維症（CF）遺伝子治療の初期の取り組みは、送達効率と持続的な治療遺伝子発現の大きな課題に直面していました。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9などの操作された部位特異的エンドヌクレアーゼの最近の進歩により、永続的なCF膜貫通コンダクタンスレギュレーター（CFTR）遺伝子の修正が可能になります。ただし、CRISPR / Cas9システムの安全性の懸念と、炎症を起こしたCF気道へのin vivo送達の課題のため、CRISPRベースの遺伝子修正戦略を適切な動物モデルでテストする必要があります。この研究では、ブタモデルでCFTR遺伝子補正をテストするためのベクターを作成することを目的としました。CRISPR / Cas9とドナーテンプレート（6 kbLacZまたは8.7kbヒトCFTR発現カセット）を培養ブタ細胞に送達するために、ヘルパー依存型アデノウイルス（HD-Ad）ベクターを構築しました。3 kbの相同性アームを用いたCas9誘導相同性指向修復により、各ドナーがGGTA1セーフハーバーに正確に統合されることを実証しました。さらに、LacZとhCFTRの両方が形質導入細胞で持続的に発現していることを示しました。さらに、CFTR補正をテストするためのCFTR欠損細胞株を作成しました。hCFTRベクターで形質導入された細胞でhCFTRmRNAとタンパク質の発現を検出しました。また、膜電位感受性色素ベースのアッセイ（FLIPR（（R）））を使用して、細胞継代後期にCRISPR-Cas9システムとhCFTRドナーを送達するHD-Adで形質導入されたCF細胞におけるCFTR機能を実証しました。ブタ気道基底細胞への遺伝子送達に関する以前のレポートと組み合わせると、これらのデータは、ブタでのHD-Adベクター送達によるCRISPR / Cas9を介した永続的なヒトCFTR補正のテストの実現可能性を提供します。"]
[47,30820813,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","MSTN; FGF10","In vitro cellular & developmental biology. Animal","Genome mutation after introduction of the gene editing by electroporation of Cas9 protein (GEEP) system in matured oocytes and putative zygotes.",2019,"55(4):237-242","[Hirata M et al.]","Tokushima University, Tokushima, Japan.",30820813,"10.1007/s11626-019-00338-3 ","The application of CRISPR/Cas9 strategy promises to rapidly increase the production of genetically engineered animals since it yields stably integrated transgenes. In the present study, we investigated the efficiency of target mutations after electroporation with the CRISPR/Cas9 system using sgRNAs to target the MSTN or FGF10 genes in porcine-matured oocytes and putative zygotes. Effects of pulse number (3-7 pulse repetitions) during electroporation on the embryonic development and mutation efficiency were also investigated. Our results showed that the cleavage rate of matured oocytes with electroporation treatment significantly decreased as compared with electroporated putative zygotes (p < 0.05). Moreover, the rates of blastocyst formation from oocytes/zygotes electroporated with more than 5 pulses decreased. Mutation efficiency was then assessed after sequencing the target sites in individual blastocysts derived from oocytes/zygotes electroporated by 3 and 5 pulses. No bi-allelic mutations in all  examined blastocysts were observed in this study. There were no differences in the mutation rates (50-60%) between blastocysts derived from matured oocytes electroporated by 3 and 5 pulses, irrespective of targeting gene. In the targeting MSTN gene, however, the mutation rate (12.5%) of blastocysts derived from putative zygotes electroporated by 3 pulses tended to be lower than that (60%) from 5-pulsed electroporated putative zygotes. These data indicate that the type of eggs may influence not only their development after electroporation treatment but also the mutation rate in the resulting blastocysts.","pig","CRISPR / Cas9戦略の適用は、安定して統合された導入遺伝子を生み出すため、遺伝子改変動物の生産を急速に増加させることを約束します。本研究では、ブタ成熟卵母細胞および推定接合子のMSTNまたはFGF10遺伝子を標的とするsgRNAを使用して、CRISPR / Cas9システムでエレクトロポレーションした後の標的変異の効率を調査しました。エレクトロポレーション中のパルス数（3〜7パルスの繰り返し）が胚発生と突然変異効率に及ぼす影響も調べました。我々の結果は、エレクトロポレーション処理による成熟卵母細胞の卵割率が、エレクトロポレーションされた推定接合子と比較して有意に減少したことを示した（p <0.05）。さらに、5パルス以上でエレクトロポレーションした卵母細胞/接合子からの胚盤胞形成率が低下しました。次に、3および5パルスでエレクトロポレーションした卵母細胞/接合子に由来する個々の胚盤胞の標的部位を配列決定した後、突然変異効率を評価しました。この研究では、調べたすべての胚盤胞に二対立遺伝子変異は観察されませんでした。ターゲティング遺伝子に関係なく、3パルスと5パルスでエレクトロポレーションした成熟卵母細胞に由来する胚盤胞間で突然変異率（50〜60％）に差はありませんでした。しかし、標的MSTN遺伝子では、3パルスでエレクトロポレーションした推定接合子に由来する胚盤胞の突然変異率（12.5％）は、5パルスのエレクトロポレーションした推定接合子の突然変異率（60％）よりも低い傾向がありました。これらのデータは、卵の種類がエレクトロポレーション処理後の発育だけでなく、結果として生じる胚盤胞の突然変異率にも影響を与える可能性があることを示しています。"]
[48,31523199,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","CD163","International journal of biological sciences","Deletion of CD163 Exon 7 Confers Resistance to Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Viruses on Pigs.",2019,"15(9):1993-2005","[Wang H et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",31523199,"10.7150/ijbs.34269 ","Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) caused by PRRS virus (PRRSV) is a severe infectious disease in the swine industry. PRRSV infection is mediated by porcine CD163 (pCD163). Scavenger receptor cysteine-rich domain 5 coded by exon 7 of pCD163 is essential for PRRSV infection. In this study, we generated CD163 exon 7 deleted (CD163E7D) pigs using CRISPR/Cas9 mediated homologous recombination and somatic cell nuclear transfer (SCNT). The deletion of exon 7 had no adverse effects on CD163-associated functions. Pigs were further challenged with a highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) strain. The CD163E7D pigs exhibited mild clinical symptoms and had decreased viral loads in blood. All CD163E7D pigs survived the viral challenge, while all the WT pigs displayed severe symptoms, and 2 out of 6 WT pigs died during the challenge. Our results demonstrated that CD163 exon 7 deletion confers resistance to HP-PRRSV infection  without impairing the biological functions of CD163.","pig","PRRSウイルス（PRRSV）によって引き起こされる豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）は、豚産業における重度の感染症です。PRRSV感染は、ブタCD163（pCD163）によって媒介されます。pCD163のエクソン7によってコードされるスカベンジャー受容体システインリッチドメイン5は、PRRSV感染に不可欠です。この研究では、CRISPR / Cas9を介した相同組換えと体細胞核移植（SCNT）を使用して、CD163エクソン7欠失（CD163E7D）ブタを作製しました。エクソン7の削除は、CD163関連機能に悪影響を及ぼしませんでした。豚はさらに病原性の高いPRRSV（HP-PRRSV）株でチャレンジされました。CD163E7D豚は軽度の臨床症状を示し、血中のウイルス量が減少しました。すべてのCD163E7D豚はウイルスチャレンジを生き延びましたが、すべてのWT豚は重度の症状を示し、6頭中2頭のWT豚がチャレンジ中に死亡しました。我々の結果は、CD163エクソン7の欠失が、CD163の生物学的機能を損なうことなくHP-PRRSV感染に対する耐性を与えることを示した。"]
[49,30745836,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","CD163","International journal of biological sciences","Generation of Pigs Resistant to Highly Pathogenic-Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus through Gene Editing of CD163.",2019,"15(2):481-492","[Chen J et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30745836,"10.7150/ijbs.25862 ","Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a highly contagious disease and the most economically important disease of the swine industry worldwide. Highly pathogenic-PRRS virus (HP-PRRSV) is a variant of PRRSV, which caused high morbidity and mortality. Scavenger receptor CD163, which contains nine scavenger receptor cysteine-rich (SRCR) domains, is a key entry mediator for PRRSV. A previous study demonstrated that SRCR domain 5 (SRCR5), encoded by exon  7, was essential for PRRSV infection in vitro. Here, we substituted exon 7 of porcine CD163 with the corresponding exon of human CD163-like 1 (hCD163L1) using  a CRISPR/Cas9 system combined with a donor vector. In CD163(Mut/Mut) pigs, modifying CD163 gene had no adverse effects on hemoglobin-haptoglobin (Hb-Hp) complex clearance or erythroblast growth. In vitro infection experiments showed that the CD163 mutant strongly inhibited HP-PRRSV replication by inhibiting virus uncoating and genome release. Compared to wild-type (WT) pigs in vivo, HP-PRRSV-infected CD163(Mut/Mut) pigs showed a substantially decreased viral load in blood and relief from PRRSV-induced fever. While all WT pigs were dead, there  of four CD163(Mut/Mut) pigs survived and recovered at the termination of the experiment. Our data demonstrated that modifying CD163 remarkably inhibited PRRSV replication and protected pigs from HP-PRRSV infection, thus establishing a good  foundation for breeding PRRSV-resistant pigs via gene editing technology.","pig","豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）は伝染性の高い病気であり、世界中の豚産業で最も経済的に重要な病気です。高病原性PRRSウイルス（HP-PRRSV）は、PRRSVの変種であり、高い罹患率と死亡率を引き起こしました。9つのスカベンジャー受容体システインリッチ（SRCR）ドメインを含むスカベンジャー受容体CD163は、PRRSVの重要なエントリーメディエーターです。以前の研究では、エクソン7によってコードされるSRCRドメイン5（SRCR5）がinvitroでのPRRSV感染に不可欠であることが示されました。ここでは、ドナーベクターと組み合わせたCRISPR / Cas9システムを使用して、ブタCD163のエクソン7をヒトCD163様1（hCD163L1）の対応するエクソンに置き換えました。CD163（Mut / Mut）豚では、CD163遺伝子の改変は、ヘモグロビン-ハプトグロビン（Hb-Hp）複合体クリアランスまたは赤芽球増殖に悪影響を及ぼしませんでした。インビトロ感染実験は、CD163変異体がウイルスの脱コーティングおよびゲノム放出を阻害することによりHP-PRRSV複製を強力に阻害することを示した。インビボでの野生型（WT）ブタと比較して、HP-PRRSVに感染したCD163（Mut / Mut）ブタは、血中のウイルス量が大幅に減少し、PRRSV誘発性の発熱が軽減されたことを示しました。すべてのWT豚が死亡しましたが、4頭のCD163（Mut / Mut）豚が生存し、実験の終了時に回復しました。私たちのデータは、CD163の改変がPRRSV複製を著しく阻害し、豚をHP-PRRSV感染から保護し、遺伝子編集技術を介してPRRSV耐性豚を繁殖させるための優れた基盤を確立することを示しました。"]
[50,30767852,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","triphosphohydrolase (SAMHD1)","Journal of general virology","Human SAMHD1 restricts the xenotransplantation relevant porcine endogenous retrovirus (PERV) in non-dividing cells.",2019,"100(4):656-661","[Al-Shehabi H et al.]","Robert Koch Institute, Berlin, Germany.",30767852,"10.1099/jgv.0.001232 ","The release of porcine endogenous retrovirus (PERV) particles from pig cells is a potential risk factor during xenotransplantation by way of productively infecting the human transplant recipient. Potential countermeasures against PERV replication are restriction factors that block retroviral replication. SAMHD1 is  a triphosphohydrolase that depletes the cellular pool of dNTPs in non-cycling cells starving retroviral reverse transcription. We investigated the antiviral activity of human SAMHD1 against PERV and found that SAMHD1 potently restricts its reverse transcription in human monocytes, monocyte-derived dendritic cells (MDDC), or macrophages (MDM) and in monocytic THP-1 cells. Degradation of SAMHD1  by SIVmac Vpx or CRISPR/Cas9 knock-out of SAMHD1 allowed for PERV reverse transcription. Addition of deoxynucleosides alleviated the SAMHD1-mediated restriction suggesting that SAMHD1-mediated degradation of dNTPs restricts PERV replication in these human immune cells. In conclusion, our findings highlight SAMHD1 as a potential barrier to PERV transmission from pig transplants to human  recipients during xenotransplantation.","pig","ブタ細胞からのブタ内在性レトロウイルス（PERV）粒子の放出は、ヒト移植レシピエントに生産的に感染することによる異種移植中の潜在的な危険因子です。PERV複製に対する潜在的な対策は、レトロウイルス複製をブロックする制限要因です。SAMHD1は、レトロウイルスの逆転写が不足している非サイクリング細胞のdNTPの細胞プールを枯渇させるトリホスホヒドロラーゼです。PERVに対するヒトSAMHD1の抗ウイルス活性を調査したところ、SAMHD1は、ヒト単球、単球由来樹状細胞（MDDC）、マクロファージ（MDM）、および単球THP-1細胞における逆転写を強力に制限することがわかりました。SIVmacVpxまたはSAMHD1のCRISPR / Cas9ノックアウトによるSAMHD1の分解により、PERV逆転写が可能になりました。デオキシヌクレオシドの添加は、SAMHD1を介した制限を緩和し、SAMHD1を介したdNTPの分解がこれらのヒト免疫細胞におけるPERV複製を制限することを示唆しています。結論として、我々の調査結果は、異種移植中のブタ移植からヒトレシピエントへのPERV感染に対する潜在的な障壁としてSAMHD1を強調しています。"]
[51,31378649,"animal","pig","Cas9;","X-linked Dmd","Journal of genetics and genomics = Yi chuan xue bao","Production of non-mosaic genome edited porcine embryos by injection of CRISPR/Cas9 into germinal vesicle oocytes.",2019,"46(7):335-342","[Su X et al.]","Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.",31378649,"10.1016/j.jgg.2019.07.002 ","Genetically modified pigs represent a great promise for generating models of human diseases and producing new breeds. Generation of genetically edited pigs using somatic cell nuclear transfer (SCNT) or zygote cytoplasmic microinjection is a tedious process due to the low developmental rate or mosaicism of the founder (F0). Herein, we developed a method termed germinal vesicle oocyte gene editing (GVGE) to produce non-mosaic porcine embryos by editing maternal alleles  during the GV to M transition. Injection of Cas9 mRNA and X-linked Dmd gene-specific gRNA into GV oocytes did not affect their developmental potential.  The M oocytes edited during in vitro maturation (IVM) could develop into blastocysts after parthenogenetic activation (PA) or in vitro fertilization (IVF). Genotyping results indicated that the maternal gene X-linked Dmd could be  efficiently edited during oocyte maturation. Up to 81.3% of the edited IVF embryos were non-mosaic Dmd gene mutant embryos. In conclusion, GVGE might be a valuable method for the generation of non-mosaic maternal allele edited F0 embryos in a short simple step.","pig","遺伝子改変された豚は、人間の病気のモデルを生成し、新しい品種を生産するための大きな期待を表しています。体細胞核移植（SCNT）または接合子細胞質マイクロインジェクションを使用した遺伝的に編集されたブタの生成は、創始者（F0）の発育速度またはモザイク現象が低いため、退屈なプロセスです。ここでは、GVからMへの移行中に母体の対立遺伝子を編集することによって非モザイクのブタ胚を生成するために、胚胞卵母細胞遺伝子編集（GVGE）と呼ばれる方法を開発しました。Cas9 mRNAおよびX連鎖Dmd遺伝子特異的gRNAのGV卵母細胞への注入は、それらの発生能に影響を与えませんでした。体外成熟（IVM）中に編集された卵母細胞は、単為生殖活性化（PA）または体外受精（IVF）後に胚盤胞に発達する可能性があります。ジェノタイピングの結果は、母細胞の成熟中に母体遺伝子のX連鎖Dmdを効率的に編集できることを示しました。編集されたIVF胚の最大81.3％は、非モザイクDmd遺伝子変異胚でした。結論として、GVGEは、短い簡単なステップで非モザイク母体対立遺伝子編集F0胚を生成するための貴重な方法である可能性があります。"]
[52,30726783,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","alpha-1,3-galactosyltranferase","Journal of reproduction and development","Effects of concentration of CRISPR/Cas9 components on genetic mosaicism in cytoplasmic microinjected porcine embryos.",2019,"65(3):209-214","[Tanihara F et al.]","Tokushima University, Tokushima, Japan.",30726783,"10.1262/jrd.2018-116 ","Cytoplasmic microinjection (CI) of the CRISPR/Cas9 system enabled the induction of site-specific mutations in porcine zygotes and resulting pigs. However, mosaicism is a serious problem for genetically modified pigs. In the present study, we investigated suitable timing and concentration of CRISPR/Cas9 components for introduction into oocytes/zygotes by CI, to reduce mosaicism in the resulting blastocysts. First, we introduced 20 ng/mul of Cas9 protein and guide RNA (gRNA), targeting the alpha-1,3-galactosyltransferase (GalT) gene in oocytes before in vitro fertilization (IVF), in zygotes after IVF, or in oocytes/zygotes before and after IVF, twice. CI treatment had no detrimental effects on blastocyst formation rates. The highest value of the rate of mutant blastocysts was observed in zygotes injected after IVF. Next, we injected Cas9 protein and gRNA into zygotes after IVF at a concentration of 20 ng/mul each (20  ng/mul group) or 100 ng/mul each (100 ng/mul group). The ratio of the number of blastocysts that carried mutations to the total number of blastocysts examined in the 100 ng/mul group was significantly higher (P < 0.05) than that in the 20 ng/mul group. Although no blastocysts from the 20 ng/mul group carried a biallelic mutation, 16.7% of blastocysts from the 100 ng/mul group carried a biallelic mutation. In conclusion, increasing the concentration of Cas9 protein and gRNA is effective in generating biallelic mutant blastocysts. To reduce mosaicism, however, further optimization of the timing of CI, and the concentration of CRISPR/Cas9 components, is needed.","pig","CRISPR / Cas9システムの細胞質マイクロインジェクション（CI）により、ブタの接合子および結果として生じるブタにおける部位特異的変異の誘導が可能になりました。しかし、モザイク現象は遺伝子改変された豚にとって深刻な問題です。本研究では、結果として生じる胚盤胞のモザイク現象を低減するために、CIによる卵母細胞/接合子への導入に適したCRISPR / Cas9成分のタイミングと濃度を調査しました。まず、体外受精前の卵母細胞（IVF）、IVF後の接合子、または卵母細胞にα-1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ（GalT）遺伝子を標的とする20 ng / mulのCas9タンパク質とガイドRNA（gRNA）を導入しました。体外受精の前後の接合子、2回。CI治療は、胚盤胞形成率に悪影響を及ぼしませんでした。突然変異胚盤胞の割合の最高値は、IVF後に注入された接合子で観察されました。次に、体外受精後、Cas9タンパク質とgRNAをそれぞれ20 ng / mul（20 ng / mulグループ）または100 ng / mul（100 ng / mulグループ）の濃度で接合子に注入しました。100 ng / mul群で調べた胚盤胞の総数に対する突然変異を持った胚盤胞の数の比率は、20 ng / mul群よりも有意に高かった（P <0.05）。20 ng / mulグループの胚盤胞は2対立遺伝子変異を持っていませんでしたが、100 ng / mulグループの胚盤胞の16.7％は2対立遺伝子変異を持っていました。結論として、Cas9タンパク質とgRNAの濃度を上げることは、二対立遺伝子の変異胚盤胞を生成するのに効果的です。ただし、モザイク現象を減らすには、CIのタイミングとCRISPR / Cas9コンポーネントの濃度をさらに最適化する必要があります。"]
[53,31161741,"animal","pig","CRISPR;Cas9;"," ","Journal of veterinary science","The length of guide RNA and target DNA heteroduplex effects on CRISPR/Cas9 mediated genome editing efficiency in porcine cells.",2019,"20(3):e23","[Lv J  et al.]","Northeast Agricultural University, Harbin, China.",31161741,"10.4142/jvs.2019.20.e23 ","The clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system is a versatile genome editing  tool with high efficiency. A guide sequence of 20 nucleotides (nt) is commonly used in application of CRISPR/Cas9; however, the relationship between the length  of the guide sequence and the efficiency of CRISPR/Cas9 in porcine cells is still not clear. To illustrate this issue, guide RNAs of different lengths targeting the EGFP gene were designed. Specifically, guide RNAs of 17 nt or longer were sufficient to direct the Cas9 protein to cleave target DNA sequences, while 15 nt or shorter guide RNAs had loss-of-function. Full-length guide RNAs complemented with mismatches also showed loss-of-function. When the shortened guide RNA and target DNA heteroduplex (gRNA:DNA heteroduplex) was blocked by mismatch, the CRISPR/Cas9 would be interfered with. These results suggested the length of the gRNA:DNA heteroduplex was a key factor for maintaining high efficiency of the CRISPR/Cas9 system rather than weak bonding between shortened guide RNA and Cas9  in porcine cells.","pig","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）システムは、高効率の多用途のゲノム編集ツールです。20ヌクレオチド（nt）のガイド配列は、CRISPR / Cas9のアプリケーションで一般的に使用されます。ただし、ガイドシーケンスの長さとブタ細胞におけるCRISPR / Cas9の効率との関係はまだ明らかではありません。この問題を説明するために、EGFP遺伝子を標的とするさまざまな長さのガイドRNAを設計しました。具体的には、17 nt以上のガイドRNAは、Cas9タンパク質に標的DNA配列を切断するように指示するのに十分でしたが、15nt以下のガイドRNAは機能を失っていました。ミスマッチで補完された完全長ガイドRNAも機能喪失を示した。短縮されたガイドRNAとターゲットDNAヘテロ二本鎖（gRNA：DNAヘテロ二本鎖）がミスマッチによってブロックされた場合、CRISPR / Cas9が妨害されます。これらの結果は、gRNA：DNAヘテロ二本鎖の長さが、ブタ細胞における短縮ガイドRNAとCas9の間の弱い結合ではなく、CRISPR / Cas9システムの高効率を維持するための重要な要因であることを示唆しました。"]
[54,31413123,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","RING finger protein 114","Journal of virology","Porcine RING Finger Protein 114 Inhibits Classical Swine Fever Virus Replication  via K27-Linked Polyubiquitination of Viral NS4B.",2019,"93(21)","[Zhang Y et al.]","Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin, China.",31413123,"10.1128/JVI.01248-19 ","In the host, many RING domain E3 ligases have been reported to inhibit viral replication through various mechanisms. In a previous screen, we found that porcine RING finger protein 114 (pRNF114), a RING domain E3 ubiquitin ligase, inhibits classical swine fever virus (CSFV) replication. This study aimed to clarify the underlying antiviral mechanism of pRNF114 against CSFV. Upon CSFV infection, pRNF114 mRNA was upregulated both in vitro and in vivo CSFV replication was significantly suppressed in PK-pRNF114 cells stably expressing pRNF114 by the lentivirus-delivered system, whereas CSFV growth was enhanced in PK-15 cells with RNF114 knockout by the CRISPR/Cas9 system. The RING domain of pRNF114, which has E3 ubiquitin ligase activity, is crucial for its antiviral activity. Mechanistically, pRNF114 interacted with the CSFV NS4B protein through  their C-terminal domains, which led to the K27-linked polyubiquitination and degradation of NS4B through a proteasome-dependent pathway. Collectively, these findings indicate that pRNF114 as a critical regulator of CSFV replication and uncover a mechanism by which pRNF114 employs its E3 ubiquitin ligase activity to  inhibit CSFV replication.IMPORTANCE Porcine RING finger protein 114 (pRNF114) is  a member of the RING domain E3 ligases. In this study, it was shown that pRNF114  is a potential anti-CSFV factor and the anti-CSFV effect of pRNF114 depends on its E3 ligase activity. Notably, pRNF114 targets and catalyzes the K27-linked polyubiquitination of the NS4B protein and then promotes proteasome-dependent degradation of NS4B, inhibiting the replication of CSFV. To our knowledge, pRNF114 is the first E3 ligase to be identified as being involved in anti-CSFV activity, and targeting NS4B could be a crucial route for antiviral development.","pig","宿主では、多くのRINGドメインE3リガーゼがさまざまなメカニズムを通じてウイルス複製を阻害することが報告されています。前の画面で、RINGドメインE3ユビキチンリガーゼであるブタのRINGフィンガータンパク質114（pRNF114）が、豚コレラウイルス（CSFV）の複製を阻害することを発見しました。この研究は、CSFVに対するpRNF114の根底にある抗ウイルスメカニズムを明らかにすることを目的とした。CSFV感染時に、pRNF114mRNAはinvitroおよびinvivoの両方でアップレギュレートされましたCSFV複製はレンチウイルス送達システムによってpRNF114を安定して発現するPK-pRNF114細胞で有意に抑制されましたが、CSFV増殖はCRISPRによるRNF114ノックアウトでPK-15細胞で増強されました/ Cas9システム。E3ユビキチンリガーゼ活性を持つpRNF114のRINGドメインは、その抗ウイルス活性にとって重要です。機械論的に、pRNF114はC末端ドメインを介してCSFV NS4Bタンパク質と相互作用し、プロテアソーム依存性経路を介してNS4BのK27結合ポリユビキチン化と分解を引き起こしました。まとめると、これらの発見は、pRNF114がCSFV複製の重要な調節因子であることを示し、pRNF114がそのE3ユビキチンリガーゼ活性を利用してCSFV複製を阻害するメカニズムを明らかにします。重要ブタRINGフィンガータンパク質114（pRNF114）はRINGドメインE3リガーゼのメンバーです。 。この研究では、pRNF114が潜在的な抗CSFV因子であり、pRNF114の抗CSFV効果はそのE3リガーゼ活性に依存することが示されました。特に、pRNF114は、NS4Bタンパク質のK27にリンクされたポリユビキチン化を標的とし、触媒し、NS4Bのプロテアソーム依存性分解を促進し、CSFVの複製を阻害します。私たちの知る限り、pRNF114は抗CSFV活性に関与していると同定された最初のE3リガーゼであり、NS4Bを標的とすることは抗ウイルス開発の重要な経路となる可能性があります。"]
[55,31138220,"animal","pig","Cas9;","Melanocortin 3 receptor (MC3R)","Lipids in health and disease","Generation of an MC3R knock-out pig by CRSPR/Cas9 combined with somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology.",2019,"18(1):122","[Yin Y et al.]","Jiaxing University, Jiaxing, China.",31138220,"10.1186/s12944-019-1073-9 ","BACKGROUND: Melanocortin 3 receptor (MC3R), a rhodopsin-like G protein-coupled receptor, is an important regulator of metabolism. Although MC3R knock-out (KO) mice and rats were generated in earlier studies, the function of MC3R remains elusive. Since pig models have many advantages over rodents in metabolism research, we generated an MC3R-KO pig using a CRSPR/Cas9-based system combined with somatic cell nuclear transfer (SCNT) technology. METHOD: Four CRSPR/Cas9 target vectors were constructed and then their cleavage efficiency was tested in  porcine fetal fibroblasts (PFFs). The pX330-sgRNA1 and pX330-sgRNA4 vectors were  used to co-transfect PFFs to obtain positive colonies. PCR screening and sequencing were conducted to identify the genotype of the colonies. The biallelically modified colonies and wild-type control colonies were used simultaneously as donor cells for SCNT. A total of 1203 reconstructed embryos were transferred into 6 surrogates, of which one became pregnant. The genotypes of the resulting piglets were determined by PCR and sequencing, and off-target effects in the MC3R KO piglets were detected by sequencing. Then, offspring were  obtained through breeding and six male KO pigs were used for the growth performance analysis. RESULTS: Four vectors were constructed successfully, and their cleavage efficiencies were 27.96, 44.89, 32.72 and 38.86%, respectively. A  total of 21 mutant colonies, including 11 MC3R(-/-) and 10 MC3R(+/-) clones, were obtained, corresponding to a gene targeting efficiency of 29.17%, with 15.28% biallelic mutations. A total of 6 piglets were born, and only two MC3R KO piglets were generated, one with malformations and a healthy one. No off-target effects were detected by sequencing in the healthy mutant. Six male MC3R KO pigs were obtained in the F2 generation and their body weight and body fat were both increased compared to wild-type full siblings. CONCLUSION: A MC3R KO pig strain was generated using the CRSIPR/Cas9-based system, which makes it possible to study the biological function of MC3R in a non-rodent model.","pig","背景：ロドプシン様Gタンパク質共役型受容体であるメラノコルチン3受容体（MC3R）は、代謝の重要な調節因子です。MC3Rノックアウト（KO）マウスとラットは以前の研究で生成されましたが、MC3Rの機能はとらえどころのないままです。ブタモデルは代謝研究においてげっ歯類に比べて多くの利点があるため、体細胞核移植（SCNT）技術と組み合わせたCRSPR / Cas9ベースのシステムを使用してMC3R-KOブタを生成しました。方法：4つのCRSPR / Cas9ターゲットベクターを構築し、それらの切断効率をブタ胎児線維芽細胞（PFF）でテストしました。pX330-sgRNA1およびpX330-sgRNA4ベクターを使用してPFFをコトランスフェクトし、陽性コロニーを得ました。コロニーの遺伝子型を特定するために、PCRスクリーニングと配列決定を行った。二対立遺伝子的に改変されたコロニーおよび野生型対照コロニーは、SCNTのドナー細胞として同時に使用された。合計1203個の再構築された胚が6つの代理人に移され、そのうち1人が妊娠しました。得られた子豚の遺伝子型は、PCRとシーケンシングによって決定され、MC3RKO子豚のオフターゲット効果はシーケンシングによって検出されました。その後、繁殖により子孫を取得し、6頭の雄KOブタを成長成績分析に使用した。結果：4つのベクターが正常に構築され、それらの切断効率はそれぞれ27.96、44.89、32.72、38.86％でした。11個のMC3R（-/-）および10個のMC3R（+/-）クローンを含む、合計21個の変異コロニーが得られました。これは、遺伝子ターゲティング効率29.17％、2対立遺伝子変異15.28％に相当します。合計6頭の子豚が生まれ、MC3R KOの子豚は2頭しか生成されませんでした。1頭は奇形で、もう1頭は健康です。健康な変異体の配列決定では、オフターゲット効果は検出されませんでした。F2世代で6頭の雄MC3RKO豚が得られ、野生型の完全な兄弟と比較して、体重と体脂肪の両方が増加しました。結論：MC3R KOブタ株は、CRSIPR / Cas9ベースのシステムを使用して生成されました。これにより、非げっ歯類モデルでMC3Rの生物学的機能を研究することができます。"]
[56,30560399,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","H11","Molecular biotechnology","Improved Delivery of CRISPR/Cas9 System Using Magnetic Nanoparticles into Porcine Fibroblast.",2019,"61(3):173-180","[Hryhorowicz M et al.]","Poznan University of Life Sciences, Poznan, Poland.",30560399,"10.1007/s12033-018-0145-9 ","Genetically modified pigs play an important role in agriculture and biomedical research; hence, new efficient methods are needed to obtain genetically engineered cells and animals. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas (CRISPR-associated) system represents an effective genome editing tool. It consists of two key molecules: single guide RNA (sgRNA) and the Cas9 endonuclease that can be introduced into the cells as one plasmid. Typical delivery methods for CRISPR/Cas9 components are limited by low transfection efficiency or toxic effects on cells. Here, we describe the use of magnetic nanoparticles and gradient magnetic field to improve delivery of CRISPR/Cas9 constructs into porcine fetal fibroblasts. Polyethylenimine-coated nanoparticles with magnetic iron oxide core were used to form magnetic plasmid DNA lipoplexes. CRISPR/Cas9 construct was prepared to induce site-specific cutting at the porcine H11 locus. Quantitative assessment of genomic cleavage by  sequence trace decomposition demonstrated that the magnetofection efficiency was  more than 3.5 times higher compared to the classic lipofection method. The Tracking of Indels by Decomposition web tool precisely determined the spectrum of indels that occurred. Simultaneously, no additional cytotoxicity associated with  the utilization of magnetic nanoparticles was observed. Our results indicate that magnetofection enables effective delivery of the CRISPR/Cas9 construct into porcine fetal fibroblasts with low cell toxicity.","pig","遺伝子改変された豚は、農業や生物医学研究において重要な役割を果たしています。したがって、遺伝子操作された細胞や動物を取得するには、新しい効率的な方法が必要です。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas（CRISPR関連）システムは、効果的なゲノム編集ツールを表しています。これは、シングルガイドRNA（sgRNA）とCas9エンドヌクレアーゼの2つの重要な分子で構成されており、1つのプラスミドとして細胞に導入できます。CRISPR / Cas9コンポーネントの一般的なデリバリー方法は、トランスフェクション効率の低さや細胞への毒性作用によって制限されます。ここでは、CRISPR / Cas9コンストラクトのブタ胎児線維芽細胞への送達を改善するための磁性ナノ粒子と勾配磁場の使用について説明します。磁性酸化鉄コアを備えたポリエチレンイミンでコーティングされたナノ粒子を使用して、磁性プラスミドDNAリポプレックスを形成した。CRISPR / Cas9コンストラクトは、ブタのH11遺伝子座で部位特異的な切断を誘導するために調製されました。シーケンストレース分解によるゲノム切断の定量的評価は、マグネトフェクション効率が古典的なリポフェクション法と比較して3.5倍以上高いことを示しました。分解Webツールによるインデルの追跡は、発生したインデルのスペクトルを正確に決定しました。同時に、磁性ナノ粒子の利用に関連する追加の細胞毒性は観察されませんでした。我々の結果は、マグネトフェクションが、細胞毒性の低いブタ胎児線維芽細胞へのCRISPR / Cas9コンストラクトの効果的な送達を可能にすることを示しています。"]
[57,31141512,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","CMP-N-glycolylneuraminic acid hydroxylase","PloS one","Lessening of porcine epidemic diarrhoea virus susceptibility in piglets after editing of the CMP-N-glycolylneuraminic acid hydroxylase gene with CRISPR/Cas9 to nullify N-glycolylneuraminic acid expression.",2019,"14(5):e0217236","[Tu CF  et al.]","Agricultural Technology Research Institute, Xiangshan, Hsinchu, Taiwan",31141512,"10.1371/journal.pone.0217236 ","The porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) devastates the health of piglets but  may not infect piglets whose CMP-N-glycolylneuraminic acid hydroxylase (CMAH) gene is mutated (knockouts, KO) by using CRISPR/Cas9 gene editing techniques. This hypothesis was tested by using KO piglets that were challenged with PEDV. Two single-guide RNAs targeting the CMAH gene and Cas9 mRNA were microinjected into the cytoplasm of newly fertilized eggs. Four live founders generated and proven to be biallelic KO, lacking detectable N-glycolylneuraminic acid (NGNA). The founders were bred, and homozygous offspring were obtained. Two-day-old (in exps. I, n = 6, and III, n = 15) and 3-day-old (in exp. II, n = 9) KO and wild-type (WT, same ages in respective exps.) piglets were inoculated with TCID50 1x103 PEDV and then fed 20 mL of infant formula (in exps. I and II) or sow's colostrum (in exp. III) every 4 hours. In exp. III, the colostrum was offered 6 times and was then replaced with Ringer/5% glucose solution. At 72 hours post-PEDV inoculation (hpi), the animals either deceased or euthanized were necropsied and intestines were sampled. In all 3 experiments, the piglets showed  apparent outward clinical manifestations suggesting that infection occurred despite the CMAH KO. In exp. I, all 6 WT piglets and only 1 of 6 KO piglets died  at 72 hpi. Histopathology and immunofluorescence staining showed that the villus  epithelial cells of WT piglets were severely exfoliated, but only moderate exfoliation and enterocyte vacuolization was observed in KO piglets. In exp. II,  delayed clinical symptoms appeared, yet the immunofluorescence staining/histopathologic inspection (I/H) scores of the two groups differed little. In exp. III, the animals exhibited clinical and pathological signs after  inoculation similar to those in exp. II. These results suggest that porcine CMAH  KO with nullified NGNA expression are not immune to PEDV but that this KO may lessen the severity of the infection and delay its occurrence.","pig","ブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）は子豚の健康を損ないますが、CRISPR / Cas9遺伝子編集技術を使用してCMP-N-グリコリルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（CMAH）遺伝子が変異している子豚（ノックアウト、KO）には感染しない可能性があります。この仮説は、PEDVでチャレンジされたKO子豚を使用してテストされました。CMAH遺伝子とCas9mRNAを標的とする2つのシングルガイドRNAを、新たに受精した卵子の細胞質にマイクロインジェクションしました。4人の生きた創設者が生成し、検出可能なN-グリコリルノイラミン酸（NGNA）を欠く2対立遺伝子のKOであることが証明されました。創設者は繁殖され、ホモ接合の子孫が得られました。2日齢（実験I、n = 6、III、n = 15）および3日齢（実験II、n = 9）KOおよび野生型（WT、それぞれ同じ年齢） exps。）子豚にTCID50 1x103 PEDVを接種し、4時間ごとに20 mLの乳児用調製粉乳（exp。IおよびII）または雌ブタの初乳（exp。III）を与えました。expで。III、初乳は6回提供され、その後リンガー/ 5％グルコース溶液と交換されました。PEDV接種（hpi）の72時間後に、死亡または安楽死させた動物を剖検し、腸をサンプリングしました。3つの実験すべてにおいて、子豚は明らかな外向きの臨床症状を示し、CMAHKOにもかかわらず感染が起こったことを示唆しています。expで。私、6頭のWT子豚すべてと6頭のKO子豚のうち1頭だけが72hpiで死亡しました。組織病理学および免疫蛍光染色は、WT子豚の絨毛上皮細胞がひどく剥離したことを示したが、KO子豚では中程度の剥離および腸細胞空胞化のみが観察された。expで。II、遅延した臨床症状が現れたが、2つのグループの免疫蛍光染色/組織病理学的検査（I / H）スコアはほとんど異ならなかった。expで。III、動物は、実験と同様の接種後に臨床的および病理学的兆候を示した。II。これらの結果は、NGNA発現が無効になっているブタCMAH KOはPEDVの影響を受けないが、このKOは感染の重症度を軽減し、その発生を遅らせる可能性があることを示唆しています。"]
[58,31560477,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","insulin receptor substrate 2","Polish journal of veterinary sciences","Porcine insulin receptor substrate 2: molecular cloning, tissues distribution, and functions in hepatocyte and aortic endothelial cells.",2019,"22(3):589-598","[Yin Z et al.]","Northeast Agricultural University, Harbin, China.",31560477,"10.24425/pjvs.2019.129968 ","Insulin receptor substrate 2 (IRS-2) modulates the phosphatidylinositol 3-kinase  (PI3K)/Akt pathway, which controls the suppression of gluconeogenic genes; IRS-2  is also a critical node of insulin signaling. Because of the high homology between pig and human IRS-2, we investigated the expression pattern and function  of porcine IRS-2. QPCR and immunoblotting were used to detect the IRS-2 expression level in different tissues. There were high IRS-2 levels in the cerebral cortex, hypothalamus, and cerebellum in the central nervous system. In peripheral tissues, IRS-2 was expressed at relatively high levels in the liver. Immunohistochemistry analysis revealed that IRS-2 was mainly distributed in the hypothalamus and cerebral cortex. Furthermore, IRS-2 knockdown porcine hepatocytes and porcine aortic endothelial cells (PAECs) were generated. The IRS-2 knockdown induced abnormal expression of genes involved in glycolipid metabolism in hepatocytes and reduced the antiatherosclerosis ability in PAECs. In addition, we disrupted IRS-2 in porcine embryonic fibroblasts (PEFs) using the CRISPR/Cas9 genome editing system, before finally generating IRS-2 knockout embryos by somatic cell nuclear transfer (SCNT). Taken together, our results indicate that IRS-2 might be a valuable target to establish diabetes and vascular disease models in the pig.","pig","インスリン受容体基質2（IRS-2）は、糖新生遺伝子の抑制を制御するホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）/ Akt経路を調節します。IRS-2は、インスリンシグナル伝達の重要なノードでもあります。ブタとヒトのIRS-2は相同性が高いため、ブタのIRS-2の発現パターンと機能を調べました。QPCRとイムノブロッティングを使用して、さまざまな組織でIRS-2の発現レベルを検出しました。中枢神経系の大脳皮質、視床下部、および小脳で高いIRS-2レベルがありました。末梢組織では、IRS-2は肝臓で比較的高レベルで発現していました。免疫組織化学分析により、IRS-2は主に視床下部と大脳皮質に分布していることが明らかになりました。さらに、IRS-2ノックダウンブタ肝細胞およびブタ大動脈内皮細胞（PAEC）が生成されました。IRS-2ノックダウンは、肝細胞の糖脂質代謝に関与する遺伝子の異常な発現を誘発し、PAECの抗アテローム性動脈硬化症の能力を低下させました。さらに、CRISPR / Cas9ゲノム編集システムを使用してブタ胚性線維芽細胞（PEF）のIRS-2を破壊した後、体細胞核移植（SCNT）によってIRS-2ノックアウト胚を最終的に生成しました。まとめると、我々の結果は、IRS-2がブタの糖尿病および血管疾患モデルを確立するための貴重な標的である可能性があることを示しています。"]
[59,30997769,"animal","pig","ZFN;","GGTA1","Polish journal of veterinary sciences","Production of ZFN-mediated GGTA1 knock-out pigs by microinjection of gene constructs into pronuclei of zygotes.",2019,"22(1):91-100","[Lipinski D et al.]","Poznan University of Life Sciences, Poznan, Poland.",30997769,"10.24425/pjvs.2018.125611 ","Animals as a source of organs and tissues for xenotransplantation could become a  backup solution for the growing shortage of human donors. The presence of human xenoreactive anti- bodies directed against Galalpha1,3Gal antigens on the cell surface of a pig donor triggers the activa- tion of the complement leading to a hyperacute reaction. The development of genetic engineer- ing techniques has enabled the modification of genomes by knocking in and/or knocking out genes. In  this paper, we report the generation of modified pigs with ZFN mediated disruption of the GGTA1 gene encoding the enzyme responsible for synthesis of Galalpha1,3Gal antigens. ZFN plasmids designed to target the exon 9 region of the pig GGTA1 gene encoding the catalytic domain were injected into the pronuclei of  fertilized egg cells. Among 107 piglets of the F0 gene- ration analyzed, one female with 9-nt deletion in exon 9 of the GGTA1 gene was found. 13 of 33 piglets of the F1 generation represented the +/- GGTA1 genotype and 2 of 13 F2 piglets repre- sented the -/- GGTA1 genotype. No changes in the animals' behavior, phenotype or karyotype were observed. Analysis confirmed heredity of the trait in all animals. A complex functional analysis of the modified animals, including flow cytometry, human serum cytotoxicity test and immunohistochemical detection,  was performed to estimate the phenotype effect of genetic modification and this indicated an efficient GGTA1 knock-out in modified pigs.","pig","異種移植のための臓器および組織の供給源としての動物は、増大するヒトドナーの不足に対するバックアップソリューションになる可能性があります。ブタドナーの細胞表面にGalalpha1,3Gal抗原に対するヒト異種反応性抗体が存在すると、補体の活性化が引き起こされ、超急性反応が引き起こされます。遺伝子工学技術の開発により、遺伝子をノックインおよび/またはノックアウトすることにより、ゲノムの改変が可能になりました。この論文では、Galalpha1,3Gal抗原の合成に関与する酵素をコードするGGTA1遺伝子のZFNを介した破壊を伴う改変ブタの生成について報告します。触媒ドメインをコードするブタGGTA1遺伝子のエクソン9領域を標的とするように設計されたZFNプラスミドを受精卵細胞の前核に注入した。分析されたF0世代の107頭の子豚の中で、GGTA1遺伝子のエクソン9に9ntの欠失を持つ雌が1頭見つかりました。F1世代の33匹の子豚のうち13匹は+/- GGTA1遺伝子型を表し、13匹のF2子豚のうち2匹は-/-GGTA1遺伝子型を表した。動物の行動、表現型または核型の変化は観察されなかった。分析により、すべての動物の形質の遺伝が確認されました。フローサイトメトリー、ヒト血清細胞毒性試験および免疫組織化学的検出を含む改変動物の複雑な機能分析を実施して、遺伝子改変の表現型効果を推定し、これは改変ブタにおける効率的なGGTA1ノックアウトを示した。"]
[60,31515498,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","aminopeptidase-N","Scientific reports","Aminopeptidase N-null neonatal piglets are protected from transmissible gastroenteritis virus but not porcine epidemic diarrhea virus.",2019,"9(1):13186","[Luo L et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang, China.",31515498,"10.1038/s41598-019-49838-y ","Swine enteric diseases have caused significant economic loss and have been considered as the major threat to the global swine industry. Several coronaviruses, including transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), have been identified as the causative agents of these diseases. Effective measures to control these diseases are lacking. The major host cells of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus have thought to be epithelial cells on small intestine villi. Aminopeptidase-N (APN) has been described as the putative receptor for entry of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus into cells in vitro. Recently, Whitworth et al. have reported that APN knockout pigs are resistant to TGEV but not PEDV after weaning. However, it remains unclear if  APN-null neonatal pigs are protected from TGEV. Here we report the generation of  APN-null pigs by using CRISPR/Cas9 technology followed by somatic cell nuclear transfer. APN-null pigs are produced with normal pregnancy rate and viability, indicating lack of APN is not embryonic lethal. After viral challenge, APN-null neonatal piglets are resistant to highly virulent transmissible gastroenteritis virus. Histopathological analyses indicate APN-null pigs exhibit normal small intestine villi, while wildtype pigs show typical lesions in small intestines. Immunochemistry analyses confirm that no transmissible gastroenteritis virus antigen is detected in target tissues in APN-null piglets. However, upon porcine  epidemic diarrhea virus challenge, APN-null pigs are still susceptible with 100%  mortality. Collectively, this report provides a viable tool for producing animals with enhanced resistance to TGEV and clarifies that APN is dispensable for the PEDV infection in pigs.","pig","豚の腸疾患は重大な経済的損失を引き起こし、世界の豚産業に対する主要な脅威と見なされてきました。伝染性胃腸炎ウイルス（TGEV）やブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）を含むいくつかのコロナウイルスが、これらの疾患の原因物質として特定されています。これらの病気を制御するための効果的な対策が不足しています。ブタ伝染性胃腸炎ウイルスとブタ流行性下痢ウイルスの主要な宿主細胞は、小腸絨毛の上皮細胞であると考えられてきました。アミノペプチダーゼ-N（APN）は、ブタ伝染性胃腸炎ウイルスおよびブタ流行性下痢ウイルスがinvitroで細胞に侵入するための推定受容体として説明されています。最近、ウィットワース等。APNノックアウト豚は離乳後のTGEVには耐性がありますが、PEDVには耐性がないことが報告されています。ただし、APNヌル新生豚がTGEVから保護されているかどうかは不明なままです。ここでは、CRISPR / Cas9テクノロジーとそれに続く体細胞核移植を使用したAPNヌルブタの生成について報告します。APNヌル豚は、正常な妊娠率と生存率で生産されており、APNの欠如が胚の致死性ではないことを示しています。ウイルスチャレンジ後、APNヌル新生子豚は非常に毒性の高い伝染性胃腸炎ウイルスに耐性があります。組織病理学的分析は、APNヌルブタが正常な小腸絨毛を示すのに対し、野生型ブタは小腸に典型的な病変を示すことを示しています。免疫化学分析により、APN欠損子豚の標的組織で伝染性胃腸炎ウイルス抗原が検出されないことが確認されています。ただし、ブタの流行性下痢ウイルスに挑戦しても、APNヌルのブタは依然として100％の死亡率で感受性があります。まとめると、このレポートは、TGEVに対する耐性が強化された動物を生産するための実行可能なツールを提供し、APNが豚のPEDV感染に不可欠であることを明らかにしています。"]
[61,31761839,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","trex2","The Journal of reproduction and development","Suppression of mosaic mutation by co-delivery of CRISPR associated protein 9 and  three-prime repair exonuclease 2 into porcine zygotes via electroporation.",2019,null,"[Yamashita S et al.]","Central Research Institute for Feed and Livestock of Zen-noh, Ibaraki, Japan.",31761839,"10.1262/jrd.2019-088 ","Gene-modified animals, including pigs, can be generated efficiently by introducing CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) into zygotes. However, in many cases, these zygotes tend to become mosaic mutants with various different mutant cell types, making it difficult to analyze the phenotype of gene-modified  founder animals. To reduce the mosaic mutations, we introduced three-prime repair exonuclease 2 (Trex2), an exonuclease that improves gene editing efficiency, into porcine zygotes along with CRISPR/Cas9 via electroporation. Although the rate of  porcine blastocyst formation decreased due to electroporation (25.9 +/- 4.6% vs.  41.2 +/- 2.0%), co-delivery of murine Trex2 (mTrex2) mRNA with CRISPR/Cas9 did not affect it any further (25.9 +/- 4.6% vs. 31.0 +/- 4.6%). In addition, there was no significant difference in the diameter of blastocysts carrying CRISPR/Cas9 (164.7 +/- 10.2 mum), and those with CRISPR/Cas9 + mTrex2 (151.9 +/- 5.1 mum) as  compared to those from the control group (178.9 +/- 9.0 mum). These results revealed that mTrex2 did not affect the development of pre-implantation embryo. We also found bi-allelic, as well as mono-allelic, non-mosaic homozygous mutations in the blastocysts. Most importantly, co-delivery of mTrex2 with CRISPR/Cas9 increased non-mosaic mutant blastocysts (29.3 +/- 4.5%) and reduced mosaic mutant blastocysts (70.7 +/- 4.5%) as compared to CRISPR/Cas9 alone (5.6 +/- 6.4% and92.6 +/- 8.6%, respectively). These data suggest that the co-delivery of CRISPR/Cas9 and mTrex2 is a useful method to suppress mosaic mutation.","pig","CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）を接合子に導入することにより、ブタを含む遺伝子改変動物を効率的に生成することができます。しかし、多くの場合、これらの接合子は、さまざまな異なる変異細胞タイプを持つモザイク変異体になる傾向があり、遺伝子改変された創始者動物の表現型を分析することを困難にします。モザイク変異を減らすために、エレクトロポレーションを介してCRISPR / Cas9とともにブタの接合子に遺伝子編集効率を改善するエキソヌクレアーゼである3プライム修復エキソヌクレアーゼ2（Trex2）を導入しました。エレクトロポレーションによりブタ胚盤胞形成率は低下しましたが（25.9 +/- 4.6％vs。41.2 +/- 2.0％）、マウスTrex2（mTrex2）mRNAとCRISPR / Cas9の同時送達はそれ以上影響しませんでした（25.9 +/- 4.6％vs。31.0 +/- 4.6％）。さらに、CRISPR / Cas9（164.7 +/- 10.2 mum）を運ぶ胚盤胞の直径と、CRISPR / Cas9 + mTrex2（151.9 +/- 5.1 mum）を運ぶ胚盤胞の直径に対照群と比較して有意差はありませんでした。 （178.9 +/- 9.0 mum）。これらの結果は、mTrex2が着床前胚の発生に影響を与えなかったことを明らかにしました。また、胚盤胞に二対立遺伝子および単対立遺伝子の非モザイクホモ接合変異が見られました。最も重要なことは、mTrex2とCRISPR / Cas9の同時送達により、CRISPR / Cas9単独（5.6 + /）と比較して、非モザイク変異胚盤胞（29.3 +/- 4.5％）が増加し、モザイク変異胚盤胞（70.7 +/- 4.5％）が減少したことです。 -それぞれ6.4％および92.6 +/- 8.6％）。これらのデータは、CRISPR / Cas9とmTrex2の同時配信がモザイク変異を抑制するための有用な方法であることを示唆しています。"]
[62,30315482,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","aminopeptidase N","Transgenic research","Resistance to coronavirus infection in amino peptidase N-deficient pigs.",2019,"28(1):21-32","[Whitworth KM et al.]","University of Missouri, Columbia, MO, USA.",30315482,"10.1007/s11248-018-0100-3 ","The alphacoronaviruses, transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) are sources of high morbidity and mortality in neonatal pigs, a consequence of dehydration caused by the infection and necrosis  of enterocytes. The biological relevance of amino peptidase N (ANPEP) as a putative receptor for TGEV and PEDV in pigs was evaluated by using CRISPR/Cas9 to edit exon 2 of ANPEP resulting in a premature stop codon. Knockout pigs possessing the null ANPEP phenotype and age matched wild type pigs were challenged with either PEDV or TGEV. Fecal swabs were collected daily from each animal beginning 1 day prior to challenge with PEDV until the termination of the  study. The presence of virus nucleic acid was determined by PCR. ANPEP null pigs  did not support infection with TGEV, but retained susceptibility to infection with PEDV. Immunohistochemistry confirmed the presence of PEDV reactivity and absence of TGEV reactivity in the enterocytes lining the ileum in ANPEP null pigs. The different receptor requirements for TGEV and PEDV have important implications in the development of new genetic tools for the control of enteric disease in pigs.","pig","アルファコロナウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス（TGEV）およびブタ流行性下痢ウイルス（PEDV）は、腸細胞の感染と壊死によって引き起こされる脱水症の結果として、新生児ブタの高い罹患率と死亡率の原因です。ブタにおけるTGEVおよびPEDVの推定受容体としてのアミノペプチダーゼN（ANPEP）の生物学的関連性は、CRISPR / Cas9を使用してANPEPのエクソン2を編集し、早期停止コドンをもたらすことによって評価されました。ヌルANPEP表現型を有するノックアウトブタおよび年齢が一致する野生型ブタをPEDVまたはTGEVのいずれかでチャレンジした。糞便スワブは、PEDVによるチャレンジの1日前から研究が終了するまで各動物から毎日収集されました。ウイルス核酸の存在は、PCRによって決定された。ANPEPヌルブタはTGEVによる感染をサポートしませんでしたが、PEDVによる感染に対する感受性を保持していました。免疫組織化学により、ANPEPヌルブタの回腸を裏打ちする腸細胞におけるPEDV反応性の存在とTGEV反応性の欠如が確認されました。TGEVとPEDVの異なる受容体要件は、ブタの腸疾患を制御するための新しい遺伝的ツールの開発に重要な意味を持っています。"]
[63,30951017,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","endogenous class I and class II HLA; B-cell receptor; Fc receptor genes","Transplantation","HLA Class I-sensitized Renal Transplant Patients Have Antibody Binding to SLA Class I Epitopes.",2019,"103(8):1620-1629","[Martens GR et al.]","University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA.",30951017,"10.1097/TP.0000000000002739 ","BACKGROUND: Highly sensitized patients are difficult to match with suitable renal allograft donors and may benefit from xenotransplant trials. We evaluate antibody binding from sensitized patients to pig cells and engineered single allele cells  to identify anti-human leukocyte antigen (HLA) antibody cross-species reactivity  with swine leukocyte antigen (SLA). These novel testing strategies assess HLA/SLA epitopes and antibody-binding patterns and introduce genetic engineering of SLA epitopes. METHODS: Sensitized patient sera were grouped by calculated panel reactive antibody and luminex single antigen reactivity profile and were tested with cloned GGTA1/CMAH/B4GalNT2 glycan knockout porcine cells. Pig reactivity was assessed by direct flow cytometric crossmatch and studied following elution from  pig cells. To study the antigenicity of individual class I HLA and SLA alleles in cells, irrelevant sera binding to lymphoblastoid cells were minimized by CRISPR/Cas9 elimination of endogenous class I and class II HLA, B-cell receptor,  and Fc receptor genes. Native HLA, SLA, and mutants of these proteins after mutating 144K to Q were assessed for antibody binding. RESULTS: Those with predominately anti-HLA-B&C antibodies, including Bw6 and Bw4 sensitization, frequently have low pig reactivity. Conversely, antibodies eluted from porcine cells are more commonly anti-HLA-A. Single HLA/SLA expressing engineered cells shows variable antigenicity and mutation of 144K to Q reduces antibody binding for some sensitized patients. CONCLUSIONS: Anti-HLA antibodies cross-react with SLA class I in predictable patterns, which can be identified with histocompatibility strategies, and SLA class I is a possible target of genetic engineering.","pig","背景：高度に感作された患者は、適切な腎同種移植ドナーと一致させることが困難であり、異種移植試験の恩恵を受ける可能性があります。感作された患者からブタ細胞および操作された単一対立遺伝子細胞への抗体結合を評価して、ブタ白血球抗原（SLA）との抗ヒト白血球抗原（HLA）抗体の種間反応性を特定します。これらの新しいテスト戦略は、HLA / SLAエピトープと抗体結合パターンを評価し、SLAエピトープの遺伝子工学を導入します。方法：感作された患者の血清は、計算されたパネル反応性抗体とluminex単一抗原反応性プロファイルによってグループ化され、クローン化されたGGTA1 / CMAH / B4GalNT2グリカンノックアウトブタ細胞でテストされました。ブタの反応性は、ダイレクトフローサイトメトリークロスマッチによって評価され、ブタ細胞からの溶出後に研究されました。細胞内の個々のクラスIHLAおよびSLA対立遺伝子の抗原性を研究するために、リンパ芽球様細胞への無関係な血清結合を、内因性クラスIおよびクラスII HLA、B細胞受容体、およびFc受容体遺伝子のCRISPR / Cas9除去によって最小限に抑えました。144KをQに変異させた後のネイティブHLA、SLA、およびこれらのタンパク質の変異体を抗体結合について評価しました。結果：Bw6およびBw4感作を含む、主に抗HLA-B＆C抗体を有するものは、しばしばブタの反応性が低い。逆に、ブタ細胞から溶出される抗体は、より一般的には抗HLA-Aです。単一のHLA / SLA発現操作細胞は、さまざまな抗原性を示し、144KからQへの変異により、一部の感作患者の抗体結合が低下します。結論：抗HLA抗体は、組織適合性戦略で特定できる予測可能なパターンでSLAクラスIと交差反応し、SLAクラスIは遺伝子工学のターゲットとなる可能性があります。"]
[64,31119817,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","beta2 microglobulin","Xenotransplantation","Possible detrimental effects of beta-2-microglobulin knockout in pigs.",2019,"26(6):e12525","[Sake HJ et al.]","Friedrich-Loeffler-Institut, Neustadt, Germany.",31119817,"10.1111/xen.12525 ","BACKGROUND: Despite major improvements in pig-to-primate xenotransplantation, long-term survival of xenografts is still challenging. The major histocompatibility complex (MHC) class I, which is crucial in cellular immune response, is an important xenoantigen. Abrogating MHC class I expression on xenografts might be beneficial for extending graft survival beyond current limits. METHODS: In this study, we employed the CRISPR/Cas9 system to target exon 2 of the porcine beta-2-microglobulin (B2M) gene to abrogate SLA class I expression on porcine cells. B2M-KO cells served as donor cells for somatic cell  nuclear transfer, and cloned embryos were transferred to three recipient sows. The offspring were genotyped for mutations at the B2M locus, and blood samples were analyzed via flow cytometry for the absence of SLA class I molecules. RESULTS: Pregnancies were successfully established and led to the birth of seven  viable piglets. Genomic sequencing proved that all piglets carried biallelic modifications at the B2M locus leading to a frameshift, a premature stop codon, and ultimately a functional knockout. However, survival times of these animals did not exceed 4 weeks due to unexpected disease processes. CONCLUSION: Here, we  demonstrate the feasibility of generating SLA class I knockout pigs by targeting  the porcine beta-2-microglobulin gene using the CRISPR/Cas9 system. Additionally, our findings indicate for the first time that this genetic modification might have a negative impact on the viability of the animals. These issues need to be solved to unveil the real value for xenotransplantation in the future.","pig","背景：豚から霊長類への異種移植の大幅な改善にもかかわらず、異種移植片の長期生存は依然として困難です。細胞性免疫応答に重要な主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIは、重要な異種抗原です。異種移植片でのMHCクラスI発現を無効にすることは、現在の限界を超えて移植片の生存を延長するのに有益かもしれません。方法：この研究では、CRISPR / Cas9システムを使用して、ブタのベータ-2-ミクログロブリン（B2M）遺伝子のエクソン2を標的とし、ブタ細胞でのSLAクラスIの発現を無効にしました。B2M-KO細胞は体細胞核移植のドナー細胞として機能し、クローン胚は3匹のレシピエント雌ブタに移植されました。子孫はB2M遺伝子座での突然変異について遺伝子型が決定され、血液サンプルはSLAクラスI分子の不在についてフローサイトメトリーを介して分析されました。結果：妊娠は成功裏に確立され、7匹の生存可能な子豚の誕生につながりました。ゲノム配列決定により、すべての子豚がB2M遺伝子座で二対立遺伝子修飾を持ち、フレームシフト、時期尚早の終止コドン、そして最終的には機能的なノックアウトにつながることが証明されました。しかし、これらの動物の生存期間は、予期しない病気のプロセスのために4週間を超えませんでした。結論：ここでは、CRISPR / Cas9システムを使用してブタのベータ-2-ミクログロブリン遺伝子を標的とすることにより、SLAクラスIノックアウトブタを生成する可能性を示します。さらに、私たちの調査結果は、この遺伝子組み換えが動物の生存率に悪影響を与える可能性があることを初めて示しています。これらの問題は、将来の異種移植の真の価値を明らかにするために解決する必要があります。"]
[65,31667881,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","porcine endogenous retrovirus reverse transcriptase","Xenotransplantation","Characterization of porcine endogenous retrovirus particles released by the CRISPR/Cas9 inactivated cell line PK15 clone 15.",2019,"e12563","[Godehardt AW et al.]","Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Germany.",31667881,"10.1111/xen.12563 ","The infection of human transplant recipients by porcine endogenous retrovirus (PERV) is a safety issue for xenotransplantation (XTx). CRISPR/Cas9 technology has enabled the generation of pigs free of functional PERVs, and the susceptibility of these animals to reinfection by PERVs remains unclear. To assess virological safety, we characterized a cell line in which PERVs have been  inactivated by CRISPR/Cas9 (PK15 clone 15) for its susceptibility to infectious PERV. First, basal expression of PERV pol, the porcine PERV-A receptor (POPAR), and reverse transcriptase (RT) activity of PERV were determined. PK15 clone 15 cells were inoculated with PERV and monitored post infection for virus expression and RT activity. Particles were visualized by electron microscopy. Our data show  that PK15 clone 15 cells still produce viral proteins that assemble to produce impaired viral particles. These virions have an irregular morphology that diverges from that of mature wild type. The particles are no longer infectious when tested in a downstream infection assay using supernatants of PK15 clone 15 cells to infect susceptible swine testis-IOWA (ST-IOWA) cells. The expression of  POPAR was quantified to exclude the possibility that lack of susceptibility to reinfection, for PERV-A, is caused by absence of viral host receptor(s). PK15 and PK15 clone 15 cells do, in fact, express POPAR equally. PERV RT inactivation mediated by CRISPR/Cas9 does not compromise virus assembly but affects virion structure and proviral integration. The constitutive virion production seems to maintain cellular resistance to superinfection and possibly indicates a protective side effect of this specific CRISPR/Cas9 mediated RT inactivation.","pig","ブタ内在性レトロウイルス（PERV）によるヒト移植レシピエントの感染は、異種移植（XTx）の安全性の問題です。CRISPR / Cas9テクノロジーにより、機能的なPERVのないブタの生成が可能になり、これらの動物のPERVによる再感染に対する感受性は依然として不明です。ウイルス学的安全性を評価するために、感染性PERVに対する感受性について、PERVがCRISPR / Cas9（PK15クローン15）によって不活化された細胞株の特性を明らかにしました。最初に、PERV polの基礎発現、ブタPERV-A受容体（POPAR）、およびPERVの逆転写酵素（RT）活性を測定しました。PK15クローン15細胞にPERVを接種し、感染後にウイルス発現とRT活性をモニターしました。粒子は電子顕微鏡で視覚化されました。私たちのデータは、PK15クローン15細胞が依然としてウイルスタンパク質を産生し、それが集まって障害のあるウイルス粒子を産生することを示しています。これらのビリオンは、成熟した野生型のものとは異なる不規則な形態を持っています。PK15クローン15細胞の上清を使用して、感受性の高いブタ精巣-IOWA（ST-IOWA）細胞に感染するダウンストリーム感染アッセイでテストした場合、粒子はもはや感染性ではありません。POPARの発現は、PERV-Aの再感染に対する感受性の欠如が、ウイルス宿主受容体の欠如によって引き起こされる可能性を排除するために定量化されました。PK15およびPK15クローン15細胞は、実際、POPARを同等に発現します。CRISPR / Cas9によって媒介されるPERVRTの不活性化は、ウイルスの組み立てを損なうことはありませんが、ビリオンの構造とプロウイルスの統合に影響を与えます。構成的ビリオン産生は、重複感染に対する細胞の耐性を維持しているようであり、おそらくこの特定のCRISPR / Cas9を介したRT不活化の保護的副作用を示しています。"]
[66,31591751,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","GGTA1; CMAH; B4GALNT2; SLA class I","Xenotransplantation","Viable pigs after simultaneous inactivation of porcine MHC class I and three xenoreactive antigen genes GGTA1, CMAH and B4GALNT2.",2019,"e12560","[Fischer K et al.]","Technische Universitat Munchen, Freising, Germany.",31591751,"10.1111/xen.12560 ","BACKGROUND: Cell surface carbohydrate antigens play a major role in the rejection of porcine xenografts. The most important for human recipients are alpha-1,3 Gal  (Galactose-alpha-1,3-galactose) causing hyperacute rejection, also Neu5Gc (N-glycolylneuraminic acid) and Sd(a) blood group antigens both of which are likely to elicit acute vascular rejection given the known human immune status. Porcine cells with knockouts of the three genes responsible, GGTA1, CMAH and B4GALNT2, revealed minimal xenoreactive antibody binding after incubation with human serum. However, human leucocyte antigen (HLA) antibodies cross-reacted with swine leucocyte antigen class I (SLA-I). We previously demonstrated efficient generation of pigs with multiple xeno-transgenes placed at a single genomic locus. Here we wished to assess whether key xenoreactive antigen genes can be simultaneously inactivated and if combination with the multi-transgenic background further reduces antibody deposition and complement activation. METHODS: Multiplex CRISPR/Cas9 gene editing and somatic cell nuclear transfer were used to generate pigs carrying functional knockouts of GGTA1, CMAH, B4GALNT2 and SLA class I. Fibroblasts derived from one- to four-fold knockout animals, and from multi-transgenic cells (human CD46, CD55, CD59, HO1 and A20) with the four-fold knockout were used to examine the effects on human IgG and IgM binding  or complement activation in vitro. RESULTS: Pigs were generated carrying four-fold knockouts of important xenoreactive genes. In vitro assays revealed that combination of all four gene knockouts reduced human IgG and IgM binding to  porcine kidney cells more effectively than single or double knockouts. The multi-transgenic background combined with GGTA1 knockout alone reduced C3b/c and  C4b/c complement activation to such an extent that further knockouts had no significant additional effect. CONCLUSION: We showed that pigs carrying several xenoprotective transgenes and knockouts of xenoreactive antigens can be readily generated and these modifications will have significant effects on xenograft survival.","pig","背景：細胞表面炭水化物抗原は、ブタ異種移植片の拒絶において主要な役割を果たす。ヒトのレシピエントにとって最も重要なのは、超急性拒絶反応を引き起こすα-1,3Gal（ガラクトース-α-1,3-ガラクトース）であり、Neu5Gc（N-グリコリルノイラミン酸）およびSd（a）血液型抗原もあります。既知のヒト免疫状態を考えると、急性血管拒絶反応を誘発します。責任のある3つの遺伝子、GGTA1、CMAH、およびB4GALNT2のノックアウトを持つブタ細胞は、ヒト血清とのインキュベーション後に最小限の異種反応性抗体結合を示しました。ただし、ヒト白血球抗原（HLA）抗体は、ブタ白血球抗原クラスI（SLA-I）と交差反応しました。我々は以前、単一のゲノム遺伝子座に複数の異種導入遺伝子が配置されたブタの効率的な生成を実証しました。ここでは、主要な異種反応性抗原遺伝子を同時に不活化できるかどうか、およびマルチトランスジェニックバックグラウンドとの組み合わせにより抗体沈着と補体活性化がさらに低下するかどうかを評価したいと考えました。方法：マルチプレックスCRISPR / Cas9遺伝子編集と体細胞核移植を使用して、GGTA1、CMAH、B4GALNT2、およびSLAクラスIの機能的ノックアウトを保持するブタを生成しました。1〜4倍のノックアウト動物およびマルチトランスジェニック細胞に由来する線維芽細胞（ヒトCD46、CD55、CD59、HO1およびA20）4倍ノックアウトを使用して、invitroでのヒトIgGおよびIgM結合または補体活性化への影響を調べました。結果：重要な異種反応性遺伝子の4倍のノックアウトを運ぶ豚が生成されました。インビトロアッセイは、4つすべての遺伝子ノックアウトの組み合わせが、シングルまたはダブルノックアウトよりも効果的にブタ腎臓細胞へのヒトIgGおよびIgMの結合を減少させることを明らかにした。GGTA1ノックアウトのみと組み合わせたマルチトランスジェニックバックグラウンドは、C3b / cおよびC4b / c補体の活性化を、さらなるノックアウトが有意な追加効果をもたらさない程度まで減少させました。結論：いくつかの異種保護トランスジーンと異種反応性抗原のノックアウトを保有するブタは容易に生成でき、これらの修飾は異種移植片の生存に有意な影響を与えることを示しました。"]
[67,30623494,"animal","pig","CRISPR;Cas9;","SIX1; SIX4","Xenotransplantation","Disabling of nephrogenesis in porcine embryos via CRISPR/Cas9-mediated SIX1 and SIX4 gene targeting.",2019,"26(3):e12484","[Wang J et al.]","Nanjing Medical University, Nanjing, China.",30623494,"10.1111/xen.12484 ","SIX1 and SIX4 genes play critical roles in kidney development. We evaluated the effect of these genes on pig kidney development by generating SIX1(-/-) and SIX1(-/-) /SIX4(-/-) pig foetuses using CRISPR/Cas9 and somatic cell nuclear transfer. We obtained 3 SIX1(-/-) foetuses and 16 SIX1(-/-) /SIX4(-/-) foetuses at different developmental stages. The SIX1(-/-) foetuses showed a migration block of the left kidney and a smaller size for both kidneys. The ureteric bud failed to form the normal branching and collecting system. Abnormal expressions of kidney development-related genes (downregulation of PAX2, PAX8, and BMP4 and upregulation of EYA1 and SALL1) were also observed in SIX1(-/-) foetal kidneys and confirmed in vitro in porcine kidney epithelial cells (PK15) following SIX1 gene deletion. The SIX1(-/-) /SIX4(-/-) foetuses exhibited more severe phenotypes, with most foetuses showing retarded development at early stages of gestation. The kidney developed only to the initial stage of metanephros formation. These results demonstrated that SIX1 and SIX4 are key genes for porcine metanephros development. The creation of kidney-deficient porcine foetuses provides a platform for generating human kidneys inside pigs using blastocyst complementation.","pig","SIX1およびSIX4遺伝子は、腎臓の発達に重要な役割を果たします。CRISPR / Cas9と体細胞核移植を使用してSIX1（-/-）およびSIX1（-/-）/ SIX4（-/-）ブタ胎児を生成することにより、ブタ腎臓発生に対するこれらの遺伝子の影響を評価しました。異なる発達段階で3つのSIX1（-/-）胎児と16のSIX1（-/-）/ SIX4（-/-）胎児を取得しました。SIX1（-/-）胎児は、左腎臓の移動ブロックと両方の腎臓の小さいサイズを示しました。尿管芽は、通常の分岐および集合管システムを形成できませんでした。腎臓発生関連遺伝子の異常発現（PAX2、PAX8、およびBMP4のダウンレギュレーションとEYA1およびSALL1のアップレギュレーション）もSIX1（-/-）胎児腎臓で観察され、SIX1後のブタ腎臓上皮細胞（PK15）でinvitroで確認されました。遺伝子の削除。SIX1（-/-）/ SIX4（-/-）胎児はより重篤な表現型を示し、ほとんどの胎児は妊娠初期に発育遅延を示しました。腎臓は後腎形成の初期段階までしか発達しませんでした。これらの結果は、SIX1とSIX4がブタの後腎発生の重要な遺伝子であることを示しています。腎臓欠損ブタ胎児の作成は、胚盤胞補完を使用してブタの内部でヒト腎臓を生成するためのプラットフォームを提供します。"]
[68,31754342,"animal","tibet minipig","Cas9;","tyr; il2rg; rag1","International journal of biological sciences","Optimization Strategy for Generating Gene-edited Tibet Minipigs by Synchronized Oestrus and Cytoplasmic Microinjection.",2019,"15(12):2719-2732","[Chen B et al.]","Southern Medical University, Guangzhou, China.",31754342,"10.7150/ijbs.35930 ","The Tibet minipig is a rare highland pig breed worldwide and has many applications in biomedical and agricultural research. However, Tibet minipigs are not like domesticated pigs in that their ovulation number is low, which is unfavourable for the collection of zygotes. Partly for this reason, few studies have reported the successful generation of genetically modified Tibet minipigs by zygote injection. To address this issue, we described an efficient way to generate gene-edited Tibet minipigs, the major elements of which include the utilization of synchronized oestrus instead of superovulation to obtain zygotes,  optimization of the preparation strategy, and co-injection of clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences associated protein 9 (Cas9) mRNA and single-guide RNAs (sgRNAs) into the cytoplasm of zygotes. We successfully obtained allelic TYR gene knockout (TYR (-/-)) Tibet minipigs with a typical albino phenotype (i.e., red-coloured eyes with light pink-tinted irises and no pigmentation in the skin and hair) as well as TYR (-/-) IL2RG (-/-) and TYR (-/-) RAG1 (-/-) Tibet minipigs with typical phenotypes of albinism and immunodeficiency, which was characterized by thymic atrophy and abnormal immunocyte proportions. The overall gene editing efficiency was 75% for the TYR single gene knockout, while for TYR-IL2RG and TYR-RAG1 dual gene editing, the values were 25% and 75%, respectively. No detectable off-target mutations were observed. By intercrossing F0 generation minipigs, targeted genetic mutations can also be transmitted to gene-edited minipigs' offspring through germ line transmission. This study is a valuable exploration for the efficient generation of gene-edited Tibet minipigs with medical research value in the future.","pig","チベットのミニブタは、世界中で珍しい高地の豚の品種であり、生物医学および農業研究で多くの用途があります。しかし、チベットのミニブタは排卵数が少ないという点で飼いならされたブタとは異なり、接合子の収集には不利です。部分的にこの理由のために、接合子注射による遺伝子組み換えチベットミニブタの成功した生成を報告した研究はほとんどありません。この問題に対処するために、遺伝子編集されたチベットミニブタを生成する効率的な方法について説明しました。その主な要素には、受精卵を得るための過剰排卵の代わりに同期した発情の利用、準備戦略の最適化、およびクラスター化された規則的な間隔の同時注入が含まれます短いパリンドローム反復配列は、タンパク質9（Cas9）mRNAおよびシングルガイドRNA（sgRNA）を接合子の細胞質に関連付けました。対立遺伝子TYR遺伝子ノックアウト（TYR（-/-））典型的なアルビノ表現型（すなわち、淡いピンク色の菖蒲があり、皮膚や髪に色素沈着がない赤色の目）のチベットミニブタとTYR（- /-）IL2RG（-/-）およびTYR（-/-）RAG1（-/-）胸腺萎縮および異常な免疫細胞比率を特徴とする、白皮症および免疫不全の典型的な表現型を有するチベットミニブタ。全体的な遺伝子編集効率は、TYRシングル遺伝子ノックアウトで75％でしたが、TYR-IL2RGおよびTYR-RAG1デュアル遺伝子編集では、値はそれぞれ25％および75％でした。検出可能なオフターゲット変異は観察されませんでした。F0世代のミニブタを交配することにより、標的となる遺伝子変異は、生殖細胞系列の伝達を通じて遺伝子編集されたミニブタの子孫にも伝達されます。この研究は、将来の医学研究価値を備えた遺伝子編集チベットミニブタを効率的に生成するための貴重な調査です。"]
[69,31041890,"animal","yorkshire pig","CRISPR;Cas9","KIT","BMC molecular and cell biology","Highly efficient correction of structural mutations of 450 kb KIT locus in kidney cells of Yorkshire pig by CRISPR/Cas9.",2019,"20(1):4","[Qin K et al.]","Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.",31041890,"10.1186/s12860-019-0184-5 ","The white coat colour of Yorkshire and Landrace pig breeds is caused by the dominant white I allele of KIT, associated with 450-kb duplications and a splice  mutation (G > A) at the first base in intron 17. To test whether genome editing can be employed to correct this structural mutation, and to investigate the role  of KIT in the control of porcine coat colour, we designed sgRNAs targeting either intron 16 or intron 17 of KIT, and transfected Cas9/sgRNA co-expression plasmids  into the kidney cells of Yorkshire pigs. The copy number of KIT was reduced by about 13%, suggesting the possibility of obtaining cells with corrected structural mutations of the KIT locus. Using single cell cloning, from 24 successfully expanded single cell clones derived from cells transfected with sgRNA targeting at intron 17, we obtained 3 clones with a single copy of KIT without the splice mutation. Taken together, the 12.5% (3/24) efficiency of correction of structural mutations of 450 kb fragments is highly efficient, providing a solid basis for the generation of genome edited Yorkshire pigs with a normal KIT locus. This provides an insight into the underlying genetic mechanisms of porcine coat colour.","pig","ヨークシャーとランドレースの豚の品種の白衣の色は、イントロン17の最初の塩基で450 kbの重複とスプライス変異（G> A）に関連するKITの優勢な白いI対立遺伝子によって引き起こされます。この構造変異を修正し、豚の毛色の制御におけるKITの役割を調査するために、KITのイントロン16またはイントロン17のいずれかをターゲットとするsgRNAを設計し、Cas9 / sgRNA共発現プラスミドをの腎臓細胞にトランスフェクトしました。ヨークシャー豚。KITのコピー数は約13％減少し、KIT遺伝子座の構造変異が修正された細胞が得られる可能性が示唆されました。単一細胞クローニングを使用して、イントロン17を標的とするsgRNAでトランスフェクトされた細胞に由来する24の正常に増殖した単一細胞クローンから、スプライス変異のないKITの単一コピーを持つ3つのクローンを取得しました。まとめると、450 kbフラグメントの構造変異の修正の12.5％（3/24）の効率は非常に効率的であり、正常なKIT遺伝子座を持つゲノム編集されたヨークシャー豚の生成の確固たる基盤を提供します。これは、豚の毛色の根底にある遺伝的メカニズムへの洞察を提供します。"]
[70,30911407,"animal","Yucatan minipig","CRISPR;Cas9;","LMNA","Cell discovery","Generation and characterization of a novel knockin minipig model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome.",2019,"5:16","[Dorado B et al.]","Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain.",30911407,"10.1038/s41421-019-0084-z ","Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) is an extremely rare genetic disorder for which no cure exists. The disease is characterized by premature aging and inevitable death in adolescence due to cardiovascular complications. Most HGPS patients carry a heterozygous de novo LMNA c.1824C > T mutation, which provokes the expression of a dominant-negative mutant protein called progerin. Therapies proven effective in HGPS-like mouse models have yielded only modest benefit in HGPS clinical trials. To overcome the gap between HGPS mouse models and patients, we have generated by CRISPR-Cas9 gene editing the first large animal model for HGPS, a knockin heterozygous LMNA c.1824C > T Yucatan minipig. Like HGPS patients, HGPS minipigs endogenously co-express progerin and normal lamin A/C, and exhibit severe growth retardation, lipodystrophy, skin and bone alterations,  cardiovascular disease, and die around puberty. Remarkably, the HGPS minipigs recapitulate critical cardiovascular alterations seen in patients, such as left ventricular diastolic dysfunction, altered cardiac electrical activity, and loss  of vascular smooth muscle cells. Our analysis also revealed reduced myocardial perfusion due to microvascular damage and myocardial interstitial fibrosis, previously undescribed readouts potentially useful for monitoring disease progression in patients. The HGPS minipigs provide an appropriate preclinical model in which to test human-size interventional devices and optimize candidate therapies before advancing to clinical trials, thus accelerating the development  of effective applications for HGPS patients.","pig","ハッチンソン-ギルフォード早老症候群（HGPS）は、治療法が存在しない非常にまれな遺伝性疾患です。この病気は、心血管系の合併症による青年期の早期老化と必然的な死を特徴としています。ほとんどのHGPS患者は、ヘテロ接合型のde novo LMNA c.1824C> T変異を持っており、プロジェリンと呼ばれるドミナントネガティブ変異タンパク質の発現を引き起こします。HGPSのようなマウスモデルで効果的であることが証明された治療法は、HGPS臨床試験でわずかな利益しかもたらしませんでした。HGPSマウスモデルと患者の間のギャップを克服するために、CRISPR-Cas9遺伝子編集により、HGPSの最初の大型動物モデルであるノックインヘテロ接合LMNA c.1824C> Tユカタンミニブタを生成しました。HGPS患者と同様に、HGPSミニブタは内因的にプロジェリンと正常なラミンA / Cを共発現し、重度の成長遅延、脂肪異栄養症、皮膚と骨の変化、心血管疾患を示し、思春期前後に死亡します。注目すべきことに、HGPSミニブタは、左心室拡張機能障害、心臓の電気的活動の変化、血管平滑筋細胞の喪失など、患者に見られる重大な心血管の変化を再現します。私たちの分析はまた、微小血管損傷および心筋間質性線維症による心筋灌流の減少を明らかにしました。これは、患者の疾患進行を監視するために潜在的に有用な、これまでに説明されていない読み出しです。HGPSミニブタは、臨床試験に進む前に、人間サイズの介入装置をテストし、候補治療を最適化するための適切な前臨床モデルを提供し、HGPS患者のための効果的なアプリケーションの開発を加速します。"]
[71,30930940,"animal","sheep","CRISPR;Cas9;","suppresor cytokine signaling 2","Frontiers in genetics","Programmable Base Editing of the Sheep Genome Revealed No Genome-Wide Off-Target  Mutations.",2019,"10:215","[Zhou S et al.]","Northwest A&F University, Yangling, China.",30930940,"10.3389/fgene.2019.00215 ","Since its emergence, CRISPR/Cas9-mediated base editors (BEs) with cytosine deaminase activity have been used to precisely and efficiently introduce single-base mutations in genomes, including those of human cells, mice, and crop  species. Most production traits in livestock are induced by point mutations, and  genome editing using BEs without homology-directed repair of double-strand breaks can directly alter single nucleotides. The p.96R > C variant of Suppressor cytokine signaling 2 (SOCS2) has profound effects on body weight, body size, and  milk production in sheep. In the present study, we successfully obtained lambs with defined point mutations resulting in a p.96R > C substitution in SOCS2 by the co-injection of BE3 mRNA and a single guide RNA (sgRNA) into sheep zygotes. The observed efficiency of the single nucleotide exchange in newborn animals was  as high as 25%. Observations of body size and body weight in the edited group showed that gene modification contributes to enhanced growth traits in sheep. Moreover, targeted deep sequencing and unbiased family trio-based whole genome sequencing revealed undetectable off-target mutations in the edited animals. This study demonstrates the potential for the application of BE-mediated point mutations in large animals for the improvement of production traits in livestock  species.","sheep","その出現以来、シトシンデアミナーゼ活性を有するCRISPR / Cas9を介した塩基エディター（BE）は、ヒト細胞、マウス、作物種などのゲノムに単一塩基変異を正確かつ効率的に導入するために使用されてきました。家畜のほとんどの生産形質は点突然変異によって誘発され、二本鎖切断の相同性指向修復なしでBEを使用したゲノム編集は、単一ヌクレオチドを直接変更することができます。サプレッサーサイトカインシグナル伝達2（SOCS2）のp.96R> C変異体は、羊の体重、体の大きさ、および乳量に大きな影響を及ぼします。本研究では、BE3 mRNAとシングルガイドRNA（sgRNA）をヒツジ接合子に同時注入することにより、SOCS2でp.96R> C置換をもたらす定義された点突然変異を伴う子羊の取得に成功しました。新生児動物で観察された一塩基交換の効率は25％と高かった。編集されたグループの体の大きさと体重の観察は、遺伝子組み換えが羊の成長特性の向上に寄与することを示しました。さらに、ターゲットを絞ったディープシーケンスとバイアスのないファミリートリオベースの全ゲノムシーケンスにより、編集された動物で検出できないオフターゲット変異が明らかになりました。この研究は、家畜種の生産特性を改善するために、大型動物にBEを介した点突然変異を適用する可能性を示しています。"]
[72,30926307,"animal","sheep","CRISPR;Cas9;","Fibroblast growth factor 5","Gene","Bioinformatics analysis of evolutionary characteristics and biochemical structure of FGF5 Gene in sheep.",2019,"702:123-132","[Zhang R et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30926307,"10.1016/j.gene.2019.03.040 ","Fibroblast growth factor (FGF) 5 regulates the development and periodicity of hair follicles, which can affect hair traits. Loss-of-function mutations associated with long-hair phenotypes have been described in several mammalian species. Sheep is an important economic animal, however, the evolution characterizations and biological mechanism of oFGF5 (Ovis aries FGF5) gene are still poorly understood. In this study, oFGF5 gene was obtained by resequencing the whole genome of three Dorper sheep and RACE of two Kazakh sheep FGF5. We proposed FGF5 was phylogenetically related to FGF4 family and oFGF5 clearly orthologed to goat FGF5. Six loci were found from the positive selection results  of FGF5 and half of them located on signal peptide. The basically similar rates of function-altering substitutions in sheep and goat lineage and the rest of the  mammalian lineage of 365 SNPs indicated that the FGF5 gene was quite conservative during evolution. Homology modeling of the oFGF5 suggested that it has a highly conserved FGF superfamily domain containing 10 beta-strands. Furthermore, the protein-protein docking analysis revealed that oFGF5 have the potential to form heterodimers with oFGFR1, the predicted interaction interface of FGF5-FGFR1 heterodimer was formed mainly by residues from FGF superfamily domain. Our observations suggested the evolutionary and structural biology features of oFGF5  might be relevant to its function about hair follicle development and modulating  hair growth, and we confirmed our speculation by using the FGF5 gene editing sheep produced by CRISPR/Cas9 technology.","sheep","線維芽細胞成長因子（FGF）5は、毛包の発達と周期性を調節します。これは、毛髪の特性に影響を与える可能性があります。長髪の表現型に関連する機能喪失型変異は、いくつかの哺乳動物種で報告されています。羊は重要な経済動物ですが、oFGF5（Ovis aries FGF5）遺伝子の進化の特徴と生物学的メカニズムはまだよくわかっていません。この研究では、oFGF5遺伝子は、3頭のドーパー羊の全ゲノムと2頭のカザフ羊FGF5のRACEを再配列決定することによって得られました。我々は、FGF5が系統発生的にFGF4ファミリーに関連しており、oFGF5がヤギFGF5に明確にオルソログされていることを提案した。FGF5のポジティブセレクションの結果から6つの遺伝子座が見つかり、その半分はシグナルペプチド上にありました。ヒツジとヤギの系統および365SNPの哺乳類系統の残りの部分における機能を変化させる置換の基本的に同様の割合は、FGF5遺伝子が進化の間非常に保守的であることを示しました。oFGF5のホモロジーモデリングは、10個のベータストランドを含む高度に保存されたFGFスーパーファミリードメインを持っていることを示唆しました。さらに、タンパク質-タンパク質ドッキング分析により、oFGF5はoFGFR1とヘテロダイマーを形成する可能性があることが明らかになりました。FGF5-FGFR1ヘテロダイマーの予測される相互作用インターフェースは、主にFGFスーパーファミリードメインの残基によって形成されました。私たちの観察は、oFGF5の進化的および構造生物学的特徴が、毛包の発達および発毛の調節に関するその機能に関連している可能性があることを示唆し、CRISPR / Cas9テクノロジーによって生成されたFGF5遺伝子編集羊を使用して推測を確認しました。"]
[73,31289301,"animal","sheep","CRISPR;Cas9;","palmitoyl-protein thioesterase 1","Scientific reports","CRISPR/Cas9 mediated generation of an ovine model for infantile neuronal ceroid lipofuscinosis (CLN1 disease).",2019,"9(1):9891","[Eaton SL et al.]","University of Edinburgh, Edinburgh, UK.",31289301,"10.1038/s41598-019-45859-9 ","The neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) are a group of devastating monogenetic  lysosomal disorders that affect children and young adults with no cure or effective treatment currently available. One of the more severe infantile forms of the disease (INCL or CLN1 disease) is due to mutations in the palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) gene and severely reduces the child's lifespan to approximately 9 years of age. In order to better translate the human  condition than is possible in mice, we sought to produce a large animal model employing CRISPR/Cas9 gene editing technology. Three PPT1 homozygote sheep were generated by insertion of a disease-causing PPT1 (R151X) human mutation into the  orthologous sheep locus. This resulted in a morphological, anatomical and biochemical disease phenotype that closely resembles the human condition. The homozygous sheep were found to have significantly reduced PPT1 enzyme activity and accumulate autofluorescent storage material, as is observed in CLN1 patients. Clinical signs included pronounced behavioral deficits as well as motor deficits  and complete loss of vision, with a reduced lifespan of 17 +/- 1 months at a humanely defined terminal endpoint. Magnetic resonance imaging (MRI) confirmed a  significant decrease in motor cortical volume as well as increased ventricular volume corresponding with observed brain atrophy and a profound reduction in brain mass of 30% at necropsy, similar to alterations observed in human patients. In summary, we have generated the first CRISPR/Cas9 gene edited NCL model. This novel sheep model of CLN1 disease develops biochemical, gross morphological and in vivo brain alterations confirming the efficacy of the targeted modification and potential relevance to the human condition.","sheep","神経セロイドリポフシノース（NCL）は、現在利用可能な治療法や効果的な治療法がない子供や若年成人に影響を与える壊滅的な単一遺伝子リソソーム障害のグループです。この病気のより重篤な乳児型の1つ（INCLまたはCLN1疾患）は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ1（PPT1）遺伝子の変異によるものであり、子供の寿命を約9歳まで大幅に短縮します。マウスで可能なよりも人間の状態をよりよく翻訳するために、CRISPR / Cas9遺伝子編集技術を採用した大型動物モデルの作成を試みました。3つのPPT1ホモ接合体ヒツジは、オーソロガスヒツジ遺伝子座に病気を引き起こすPPT1（R151X）ヒト突然変異を挿入することによって生成されました。これは、人間の状態に非常に似ている形態学的、解剖学的および生化学的疾患の表現型をもたらしました。CLN1患者で観察されるように、ホモ接合性のヒツジは、PPT1酵素活性が大幅に低下し、自家蛍光貯蔵物質を蓄積することがわかりました。臨床徴候には、人道的に定義された最終エンドポイントで17 +/- 1か月の寿命の短縮を伴う、顕著な行動障害、運動障害、および完全な視力喪失が含まれていました。磁気共鳴画像法（MRI）は、人間の患者で観察された変化と同様に、運動皮質容積の有意な減少、および観察された脳萎縮に対応する心室容積の増加、および壊死時の脳量の30％の大幅な減少を確認しました。要約すると、最初のCRISPR / Cas9遺伝子編集NCLモデルを生成しました。CLN1疾患のこの新しいヒツジモデルは、生化学的、肉眼的形態学的、およびin vivoでの脳の変化を引き起こし、標的化された修飾の有効性と人間の状態との潜在的な関連性を確認します。"]
[74,30669572,"animal\n(fish)"," ","CRISPR;Cas9;"," ","Cells","Development of a Bicistronic Vector for the Expression of a CRISPR/Cas9-mCherry System in Fish Cell Lines.",2019,"8(1)","[Escobar-Aguirre S  et al.]","Universidad de Chile, Santiago, Chile.",30669572,"10.3390/cells8010075 ","The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system has been widely used in animals as an efficient genome editing tool. In fish cells, the technique has been difficult to implement due to the lack of proper vectors that use active promoters to drive the expression of both small guide RNA (sgRNA) and the S. pyogenes Cas9 (spCas9) protein within a single expression platform. Until now, fish cells have been modified using co-transfection of the mRNA of both the sgRNA and the spCas9. In the present study, we describe the optimization of a new vector for the expression of a CRISPR/Cas9 system, designed to edit the genome of fish cell lines, that combines a gene reporter (mCherry), sgRNA, and spCas9 in a single vector, facilitating the study of the efficiency of piscine and non-piscine promoters. A cassette containing the zebrafish U6 RNA III polymerase (U6ZF) promoter was used for the expression of the sgRNA. The new plasmid displayed the  expression of spCas9, mCherry, and sgRNA in CHSE/F fish cells. The results demonstrate the functionality of the mammalian promoter and the U6ZF promoter in  fish cell lines. This is the first approach aimed at developing a unified genome  editing system in fish cells using bicistronic vectors, thus creating a powerful  biotechnological platform to study gene function.","fish","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）システムは、効率的なゲノム編集ツールとして動物で広く使用されています。魚細胞では、単一の発現プラットフォーム内で小さなガイドRNA（sgRNA）と化膿レンサ球菌Cas9（spCas9）タンパク質の両方の発現を駆動するアクティブなプロモーターを使用する適切なベクターがないため、この手法を実装することは困難でした。これまで、魚の細胞は、sgRNAとspCas9の両方のmRNAのコトランスフェクションを使用して改変されてきました。本研究では、遺伝子レポーター（mCherry）、sgRNA、およびspCas9を単一のベクターに組み合わせた魚細胞株のゲノムを編集するように設計されたCRISPR / Cas9システムの発現のための新しいベクターの最適化について説明します。 、魚および非魚プロモーターの効率の研究を容易にします。ゼブラフィッシュU6RNA IIIポリメラーゼ（U6ZF）プロモーターを含むカセットをsgRNAの発現に使用しました。新しいプラスミドは、CHSE / F魚細胞でspCas9、mCherry、およびsgRNAの発現を示しました。結果は、魚の細胞株における哺乳類プロモーターとU6ZFプロモーターの機能を示しています。これは、バイシストロン性ベクターを使用して魚細胞で統一されたゲノム編集システムを開発することを目的とした最初のアプローチであり、遺伝子機能を研究するための強力なバイオテクノロジープラットフォームを作成します。"]
[75,31692207,"animal\n(fish)","Amia calva (bowfin), Oncorhynchus mykiss (trout), Petromyzon marinus (sea lamprey) and Scaphirhynchus  albus (sturgeon)","CRISPR;Cas9;","npyr1","Diabetes, obesity & metabolism","Peptide YY (1-36) peptides from phylogenetically ancient fish targeting mammalian neuropeptide Y1 receptors demonstrate potent effects on pancreatic beta-cell function, growth and survival.",2019,null,"[Lafferty RA et al.]","University of Ulster, Coleraine, UK.",31692207,"10.1111/dom.13908 ","AIM: To investigate the antidiabetic efficacy of enzymatically stable Peptide YY  (PYY) peptides from phylogenetically ancient fish. MATERIALS AND METHODS: N-terminally stabilized, PYY (1-36) sequences from Amia calva (bowfin), Oncorhynchus mykiss (trout), Petromyzon marinus (sea lamprey) and Scaphirhynchus  albus (sturgeon), were synthesized, and both biological actions and antidiabetic  therapeutic efficacy were assessed. RESULTS: All fish PYY (1-36) peptides were resistant to dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) degradation and inhibited glucose- and alanine-induced (P < 0.05 to P < 0.001) insulin secretion. In addition, PYY (1-36) peptides imparted significant (P < 0.05 to P < 0.001) beta-cell proliferative and anti-apoptotic benefits. Proliferative effects were almost entirely absent in beta cells with CRISPR-Cas9-induced knockout of Npyr1. In contrast to human PYY (1-36), the piscine-derived peptides lacked appetite-suppressive actions. Twice-daily administration of sea lamprey PYY (1-36), the superior bioactive peptide, for 21 days significantly (P < 0.05 to P  < 0.001) decreased fluid intake, non-fasting glucose and glucagon in streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. In addition, glucose tolerance, insulin sensitivity, pancreatic insulin and glucagon content were significantly improved. Metabolic benefits were linked to positive changes in pancreatic islet  morphology as a result of augmented (P < 0.001) proliferation and decreased apoptosis of beta cells. Sturgeon PYY (1-36) exerted similar but less impressive  effects in STZ mice. CONCLUSION: These observations reveal, for the first time, that PYY (1-36) peptide sequences from phylogenetically ancient fish replicate the pancreatic beta-cell benefits of human PYY (1-36) and have clear potential for the treatment of type 2 diabetes.","fish","目的：系統発生的に古代の魚からの酵素的に安定なペプチドYY（PYY）ペプチドの抗糖尿病効果を調査すること。材料と方法：Amia calva（bowfin）、Oncorhynchus mykiss（trout）、Petromyzon marinus（sealamprey）およびScaphirhynchusalbus（外科医）からのN末端安定化PYY（1-36）配列を合成し、生物学的作用と抗糖尿病治療効果を評価した。結果：すべての魚のPYY（1-36）ペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）分解に耐性があり、グルコースおよびアラニンによって誘発される（P <0.05からP <0.001）インスリン分泌を阻害しました。さらに、PYY（1-36）ペプチドは、有意な（P <0.05〜P <0.001）ベータ細胞増殖および抗アポトーシス効果をもたらしました。CRISPR-Cas9が誘導するNpyr1のノックアウトを伴うベータ細胞では、増殖効果はほとんど完全に見られませんでした。ヒトPYY（1-36）とは対照的に、魚由来のペプチドは食欲抑制作用を欠いていました。優れた生理活性ペプチドであるウミヤツメPYY（1-36）を1日2回、21日間有意に（P <0.05からP <0.001）投与すると、ストレプトゾトシン（STZ）誘発糖尿病患者の水分摂取量、非空腹時血糖値、およびグルカゴンが減少しました。マウス。さらに、耐糖能、インスリン感受性、膵臓インスリンおよびグルカゴン含有量が大幅に改善されました。代謝の利点は、ベータ細胞の増殖の増加（P <0.001）とアポトーシスの減少の結果としての膵島形態の正の変化に関連していました。チョウザメPYY（1-36）は、STZマウスで同様の効果を発揮しましたが、それほど印象的ではありませんでした。結論：これらの観察結果は、系統発生的に古代の魚からのPYY（1-36）ペプチド配列がヒトPYY（1-36）の膵臓ベータ細​​胞の利点を複製し、2型糖尿病の治療の明確な可能性を持っていることを初めて明らかにしました。"]
[76,31101849,"animal\n(fish)","atlantic salmon","CRISPR;","very long chain fatty acyl elongase (elovl2)","Scientific reports","CRISPR/Cas9-mediated ablation of elovl2 in Atlantic salmon (Salmo salar L.) inhibits elongation of polyunsaturated fatty acids and induces Srebp-1 and target genes.",2019,"9(1):7533","[Datsomor AK et al.]","Norwegian University of Science and Technology, Trondheim, Norway.",31101849,"10.1038/s41598-019-43862-8 ","Atlantic salmon can synthesize polyunsaturated fatty acids (PUFAs), such as eicosapentaenoic acid (20:5n-3), arachidonic acid (20:4n-6) and docosahexaenoic acid (22:6n-3) via activities of very long chain fatty acyl elongases (Elovls) and fatty acyl desaturases (Fads), albeit to a limited degree. Understanding molecular mechanisms of PUFA biosynthesis and regulation is a pre-requisite for sustainable use of vegetable oils in aquafeeds as current sources of fish oils are unable to meet increasing demands for omega-3 PUFAs. By generating CRISPR-mediated elovl2 partial knockout (KO), we have shown that elovl2 is crucial for multi-tissue synthesis of 22:6n-3 in vivo and that endogenously synthesized PUFAs are important for transcriptional regulation of lipogenic genes in Atlantic salmon. The elovl2-KOs showed reduced levels of 22:6n-3 and accumulation of 20:5n-3 and docosapentaenoic acid (22:5n-3) in the liver, brain and white muscle, suggesting inhibition of elongation. Additionally, elovl2-KO salmon showed accumulation of 20:4n-6 in brain and white muscle. The impaired synthesis of 22:6n-3 induced hepatic expression of sterol regulatory element binding protein-1 (srebp-1), fatty acid synthase-b, Delta6fad-a, Delta5fad and elovl5. Our study demonstrates key roles of elovl2 at two penultimate steps of PUFA synthesis in vivo and suggests Srebp-1 as a main regulator of endogenous PUFA synthesis in Atlantic salmon.","fish","アトランティックサーモンは、非常に長鎖の脂肪アシルの活性を介して、エイコサペンタエン酸（20：5n-3）、アラキドン酸（20：4n-6）、ドコサヘキサエン酸（22：6n-3）などの多不飽和脂肪酸（PUFA）を合成できます。限られた程度ではあるが、エロンガーゼ（Elovls）および脂肪アシルデサチュラーゼ（Fads）。PUFAの生合成と調節の分子メカニズムを理解することは、現在の魚油の供給源がオメガ3 PUFAの増大する需要を満たすことができないため、アクアフィードで植物油を持続可能な方法で使用するための前提条件です。CRISPRを介したelovl2パーシャルノックアウト（KO）を生成することにより、elovl2がin vivoでの22：6n-3の多組織合成に重要であり、内因的に合成されたPUFAが大西洋サーモンの脂質生成遺伝子の転写調節に重要であることを示しました。elovl2-KOは、肝臓、脳、白筋で22：6n-3のレベルの低下と、20：5n-3およびドコサペンタエン酸（22：5n-3）の蓄積を示し、伸長の阻害を示唆しています。さらに、elovl2-KOサーモンは、脳と白筋に20：4n-6の蓄積を示しました。22：6n-3の合成障害は、ステロール調節エレメント結合タンパク質-1（srebp-1）、脂肪酸シンターゼ-b、Delta6fad-a、Delta5fad、およびelovl5の肝臓での発現を誘発しました。私たちの研究は、in vivoでのPUFA合成の最後から2番目の2つのステップでのelovl2の重要な役割を示し、タイセイヨウサケの内因性PUFA合成の主な調節因子としてSrebp-1を示唆しています。"]
[77,31729437,"animal\n(fish)","Atlantic salmon (Salmo  salar L.)","CRISPR;","fatty acyl desaturase (delta5; delta6)","Scientific reports","CRISPR/Cas9-mediated editing of Delta5 and Delta6 desaturases impairs Delta8-desaturation and docosahexaenoic acid synthesis in Atlantic salmon (Salmo  salar L.).",2019,"9(1):16888","[Datsomor AK et al.]","Norwegian University of Science and Technology, ITrondheim, Norway.",31729437,"10.1038/s41598-019-53316-w ","The in vivo functions of Atlantic salmon fatty acyl desaturases (fads2), Delta6fads2-a, Delta6fads2-b, Delta6fads2-c and Delta5fads2 in long chain polyunsaturated fatty acid (LC-PUFA) synthesis in salmon and fish in general remains to be elucidated. Here, we investigate in vivo functions and in vivo functional redundancy of salmon fads2 using two CRISPR-mediated partial knockout  salmon, Delta6abc/5(Mt) with mutations in Delta6fads2-a, Delta6fads2-b, Delta6fads2-c and Delta5fads2, and Delta6bc(Mt) with mutations in Delta6fads2-b and Delta6fads2-c. F0 fish displaying high degree of gene editing (50-100%) were  fed low LC-PUFA and high LC-PUFA diets, the former containing reduced levels of eicosapentaenoic (20:5n-3) and docosahexaenoic (22:6n-3) acids but higher content of linoleic (18:2n-6) and alpha-linolenic (18:3n-3) acids, and the latter containing high levels of 20:5n-3 and 22:6n-3 but reduced compositions of 18:2n-6 and 18:3n-3. The Delta6abc/5(Mt) showed reduced 22:6n-3 levels and accumulated Delta6-desaturation substrates (18:2n-6, 18:3n-3) and Delta5-desaturation substrate (20:4n-3), demonstrating impaired 22:6n-3 synthesis compared to wildtypes (WT). Delta6bc(Mt) showed no effect on Delta6-desaturation compared to  WT, suggesting Delta6 Fads2-a as having the predominant Delta6-desaturation activity in salmon, at least in the tissues analyzed. Both Delta6abc/5(Mt) and Delta6bc(Mt) demonstrated significant accumulation of Delta8-desaturation substrates (20:2n-6, 20:3n-3) when fed low LC-PUFA diet. Additionally, Delta6abc/5(Mt) demonstrated significant upregulation of the lipogenic transcription regulator, sterol regulatory element binding protein-1 (srebp-1) in liver and pyloric caeca under reduced dietary LC-PUFA. Our data suggest a combined effect of endogenous LC-PUFA synthesis and dietary LC-PUFA levels on srebp-1 expression which ultimately affects LC-PUFA synthesis in salmon. Our data also suggest Delta8-desaturation activities for salmon Delta6 Fads2 enzymes.","fish","大西洋サーモン脂肪アシルデサチュラーゼ（fads2）、Delta6fads2-a、Delta6fads2-b、Delta6fads2-c、およびDelta5fads2の、サーモンおよび魚の長鎖多不飽和脂肪酸（LC-PUFA）合成におけるinvivo機能はまだ解明されていません。ここでは、2つのCRISPRを介したパーシャルノックアウトサーモン、Delta6fads2-a、Delta6fads2-b、Delta6fads2-c、Delta5fads2、およびDelta6bc（ Mt）Delta6fads2-bおよびDelta6fads2-cに変異がある。高度な遺伝子編集（50-100％）を示すF0魚には、低LC-PUFAおよび高LC-PUFA食が与えられ、前者にはエイコサペンタエン酸（20：5n-3）およびドコサヘキサエン酸（22：6n-3）のレベルが低下していました。酸だがリノール酸（18：2n-6）とアルファリノレン酸（18：3n-3）の含有量が高く、後者は高レベルの20：5n-3と22：6n-3を含んでいるが、18： 2n-6および18：3n-3。Delta6abc / 5（Mt）は、22：6n-3レベルの低下と、Delta6不飽和基質（18：2n-6、18：3n-3）およびDelta5不飽和基質（20：4n-3）の蓄積を示し、22の障害を示しています。 ：野生型（WT）と比較した6n-3合成。Delta6bc（Mt）は、WTと比較してDelta6の不飽和化に影響を与えず、少なくとも分析した組織では、Delta6Fads2-aがサーモンで優勢なDelta6の不飽和化活性を持っていることを示唆しています。Delta6abc / 5（Mt）とDelta6bc（Mt）の両方が、低LC-PUFA食餌を与えられたときに、Delta8不飽和基質（20：2n-6、20：3n-3）の有意な蓄積を示しました。さらに、Delta6abc / 5（Mt）は、食事のLC-PUFAを減らした状態で、脂質生成転写調節因子、肝臓および幽門のcaecaにおけるステロール調節エレメント結合タンパク質-1（srebp-1）の有意なアップレギュレーションを示しました。私たちのデータは、サーモンのLC-PUFA合成に最終的に影響を与えるsrebp-1発現に対する内因性LC-PUFA合成と食事LC-PUFAレベルの複合効果を示唆しています。私たちのデータは、サケのDelta6Fads2酵素のDelta8不飽和化活性も示唆しています。"]
[78,31177615,"animal\n(fish)","Atlantic Salmon (Salmo salar)","CRISPR;Cpf1;"," ","Molecular ecology resources","The application of CRISPR-Cas for single species identification from environmental DNA.",2019,"19(5):1106-1114","[Williams MA  et al.]","Dublin City University, Dublin, Ireland.",31177615,"10.1111/1755-0998.13045 ","We report the first application of CRISPR-Cas technology to single species detection from environmental DNA (eDNA). Organisms shed and excrete DNA into their environment such as in skin cells and faeces, referred to as environmental  DNA (eDNA). Utilising eDNA allows noninvasive monitoring with increased specificity and sensitivity. Current methods primarily employ PCR-based techniques to detect a given species from eDNA samples, posing a logistical challenge for on-site monitoring and potential adaptation to biosensor devices. We have developed an alternative method; coupling isothermal amplification to a CRISPR-Cas12a detection system. This utilises the collateral cleavage activity of Cas12a, a ribonuclease guided by a highly specific single CRISPR RNA. We used the target species Salmo salar as a proof-of-concept test of the specificity of the assay among closely related species and to show the assay is successful at a single temperature of 37 degrees C with signal detection at 535 nM. The specific  assay, detects at attomolar sensitivity with rapid detection rates (<2.5 hr). This approach simplifies the challenge of building a biosensor device for rapid target species detection in the field and can be easily adapted to detect any species from eDNA samples from a variety of sources enhancing the capabilities of eDNA as a tool for monitoring biodiversity.","fish","環境DNA（eDNA）からの単一種検出へのCRISPR-Casテクノロジーの最初のアプリケーションを報告します。生物は、環境DNA（eDNA）と呼ばれる、皮膚細胞や糞便などの環境にDNAを放出して排出します。eDNAを利用することで、特異性と感度を高めた非侵襲的モニタリングが可能になります。現在の方法は、主にPCRベースの技術を使用して、eDNAサンプルから特定の種を検出し、オンサイトモニタリングおよびバイオセンサーデバイスへの潜在的な適応にロジスティック上の課題をもたらします。別の方法を開発しました。等温増幅をCRISPR-Cas12a検出システムに結合します。これは、非常に特異的な単一のCRISPRRNAによって誘導されるリボヌクレアーゼであるCas12aの側副切断活性を利用します。密接に関連する種間のアッセイの特異性の概念証明テストとしてターゲット種Salmosalarを使用し、535nMでの信号検出で37℃の単一温度でアッセイが成功することを示しました。特定のアッセイは、迅速な検出速度（<2.5時間）でアトモル感度で検出します。このアプローチは、フィールドでの迅速な標的種検出のためのバイオセンサーデバイスを構築するという課題を簡素化し、生物多様性を監視するためのツールとしてのeDNAの機能を強化するさまざまなソースからのeDNAサンプルから任意の種を検出するように簡単に適合させることができます。"]
[79,31142600,"animal\n(fish)","chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) ","CRISPR;Cas9;","stat2","Journal of immunology","Viral Resistance and IFN Signaling in STAT2 Knockout Fish Cells.",2019,"203(2):465-475","[Dehler CE  et al.]","University of Aberdeen, Aberdeen, UK.",31142600,"10.4049/jimmunol.1801376 ","IFN belong to a group of cytokines specialized in the immunity to viruses. Upon viral infection, type I IFN is produced and alters the transcriptome of responding cells through induction of a set of IFN stimulated genes (ISGs) with regulatory or antiviral function, resulting in a cellular antiviral state. Fish genomes have both type I IFN and type II IFN (IFN-gamma), but no type III (lambda) IFN has been identified. Their receptors are not simple counterparts of  the mammalian type I/II IFN receptors, because alternative chains are used in type I IFN receptors. The mechanisms of the downstream signaling remain partly undefined. In mammals, members of the signal transducer and activator of family of transcription factors are responsible for the transmission of the signal from  cytokine receptors, and STAT2 is required for type I but not type II IFN signaling. In fish, its role in IFN signaling in fish remains unclear. We isolated a Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) cell line, GS2, with a stat2 gene knocked out by CRISPR/Cas9 genome editing. In this cell line, the induction  of ISGs by stimulation with a recombinant type I IFN is completely obliterated as evidenced by comparative RNA-seq analysis of the transcriptome of GS2 and its parental counterpart, EC. Despite a complete absence of ISGs induction, the GS2 cell line has a remarkable ability to resist to viral infections. Therefore, other STAT2-independent pathways may be induced by the viral infection, illustrating the robustness and redundancy of the innate antiviral defenses in fish.","fish","IFNは、ウイルスに対する免疫に特化したサイトカインのグループに属しています。ウイルスに感染すると、I型IFNが産生され、調節機能または抗ウイルス機能を備えた一連のIFN刺激遺伝子（ISG）の誘導を通じて応答細胞のトランスクリプトームを変化させ、細胞の抗ウイルス状態をもたらします。魚のゲノムにはI型IFNとII型IFN（IFN-γ）の両方がありますが、III型（ラムダ）IFNは同定されていません。I型IFN受容体では代替鎖が使用されているため、それらの受容体は哺乳類のI / II型IFN受容体の単純な対応物ではありません。下流のシグナル伝達のメカニズムは部分的に未定義のままです。哺乳動物では、転写因子ファミリーのシグナルトランスデューサーおよびアクチベーターのメンバーがサイトカイン受容体からのシグナルの伝達に関与し、STAT2はI型に必要ですがII型IFNシグナル伝達には必要ありません。魚では、魚のIFNシグナル伝達におけるその役割は不明なままです。CRISPR / Cas9ゲノム編集によってノックアウトされたstat2遺伝子を持つチヌークサーモン（Oncorhynchus tshawytscha）細胞株GS2を分離しました。この細胞株では、組換えI型IFNによる刺激によるISGの誘導は、GS2とその親の対応物であるECのトランスクリプトームの比較RNA-seq分析によって証明されるように、完全に消滅しています。ISG誘導が完全に欠如しているにもかかわらず、GS2細胞株はウイルス感染に抵抗する顕著な能力を持っています。したがって、他のSTAT2に依存しない経路がウイルス感染によって誘発される可能性があり、魚の生来の抗ウイルス防御の堅牢性と冗長性を示しています。"]
[80,30633441,"animal\n(fish)","clownfish (Amphiprion ocellaris)","CRISPR;Cas9;","fhl2a; fhl2b; saiyan; gpnmb; apoD1a","Pigment cell & melanoma research","Developmental and comparative transcriptomic identification of iridophore contribution to white barring in clownfish.",2019,"32(3):391-402","[Salis P et al.]","UMR CNRS 7232 BIOM, Sorbonne Universite, Banyuls-sur-Mer, France.",30633441,"10.1111/pcmr.12766 ","Actinopterygian fishes harbor at least eight distinct pigment cell types, leading to a fascinating diversity of colors. Among this diversity, the cellular origin of the white color appears to be linked to several pigment cell types such as iridophores or leucophores. We used the clownfish Amphiprion ocellaris, which has a color pattern consisting of white bars over a darker body, to characterize the  pigment cells that underlie the white hue. We observe by electron microscopy that cells in white bars are similar to iridophores. In addition, the transcriptomic signature of clownfish white bars exhibits similarities with that of zebrafish iridophores. We further show by pharmacological treatments that these cells are necessary for the white color. Among the top differentially expressed genes in white skin, we identified several genes (fhl2a, fhl2b, saiyan, gpnmb, and apoD1a) and show that three of them are expressed in iridophores. Finally, we show by CRISPR/Cas9 mutagenesis that these genes are critical for iridophore development  in zebrafish. Our analyses provide clues to the genomic underpinning of color diversity and allow identification of new iridophore genes in fish.","fish","放線菌の魚は少なくとも8つの異なる色素細胞タイプを持っており、魅力的な色の多様性をもたらします。この多様性の中で、白色の細胞起源は、イリドフォアやロイコフォアなどのいくつかの色素細胞タイプに関連しているようです。白い色合いの根底にある色素細胞を特徴づけるために、暗い体の上に白いバーで構成されるカラーパターンを持つカクレクマノミAmphiprionocellarisを使用しました。電子顕微鏡により、白いバーの細胞がイリドフォアに類似していることが観察されます。さらに、カクレクマノミの白いバーのトランスクリプトーム署名は、ゼブラフィッシュのイリドフォアのそれとの類似性を示しています。さらに、薬理学的処理により、これらの細胞が白色に必要であることを示します。白い肌で差次的に発現する上位の遺伝子の中で、いくつかの遺伝子（fhl2a、fhl2b、saiyan、gpnmb、およびapoD1a）を特定し、そのうちの3つがイリドフォアで発現していることを示しています。最後に、CRISPR / Cas9変異誘発により、これらの遺伝子がゼブラフィッシュの虹彩胞の発達に重要であることを示します。私たちの分析は、色の多様性のゲノム基盤への手がかりを提供し、魚の新しい虹彩遺伝子の同定を可能にします。"]
[81,30894668,"animal\n(fish)","japanese anchovy","CRISPR;Cas9;TALENs;"," ","Scientific reports","Comprehensive Experimental System for a Promising Model Organism Candidate for Marine Teleosts.",2019,"9(1):4948","[Sakaguchi K et al.]","Kyushu University, Saga, Japan.",30894668,"10.1038/s41598-019-41468-8 ","A comprehensive experimental system for Japanese anchovy, a promising candidate model organism for marine teleosts, was established. Through the design of a rearing/spawning facility that controls the photoperiod and water temperature, one-cell eggs were continuously obtained shortly after spawning throughout the rearing period. The stages of eggs are indispensable for microinjection experiments, and we developed an efficient and robust microinjection system for the Japanese anchovy. Embryos injected with GFP mRNA showed strong whole-body GFP fluorescence and the survival rates of injected- and non-injected embryos were not significantly different, 87.5% (28 in 32 embryos) and 90.0% (45 in 50 embryos), respectively. We verified that the Tol2 transposon system, which mediates gene transfer in vertebrates, worked efficiently in the Japanese anchovy using the transient transgenesis protocol, with GFP or DsRed as the reporter gene. Finally, we confirmed that genome-editing technologies, namely Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN) and Clustered Regulatory  Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, were applicable to the Japanese anchovy. In practice, specific gene-disrupted fishes were generated in the F1 generation. These results demonstrated the establishment of a basic, yet comprehensive, experimental system, which could be employed to undertake experiments using the Japanese anchovy as a model organism for marine teleost fish.","fish","海洋テレオストの有望なモデル生物候補である日本アンチョビの総合実験システムを確立した。光周期と水温を制御する飼育・産卵施設の設計により、産卵直後から飼育期間を通して単細胞卵を継続的に取得した。マイクロインジェクション実験には卵の段階が不可欠であり、カタクチイワシのための効率的で堅牢なマイクロインジェクションシステムを開発しました。GFP mRNAを注射した胚は、強い全身GFP蛍光を示し、注射した胚と注射していない胚の生存率に有意差はなく、それぞれ87.5％（32胚中28）と90.0％（50胚中45）でした。脊椎動物の遺伝子転移を媒介するTol2トランスポゾンシステムが、GFPまたはDsRedをレポーター遺伝子として使用して、一過性のトランスジェネシスプロトコルを使用して日本のアンチョビで効率的に機能することを確認しました。最後に、ゲノム編集技術、すなわち転写活性化因子様エフェクター核（TALEN）およびクラスター化された調節性間隔の短いパリンドローム反復（CRISPR）/ Cas9が日本のアンチョビに適用可能であることを確認した。実際には、特定の遺伝子破壊された魚はF1世代で生成されました。これらの結果は、海洋テレオスト魚のモデル生物として日本のアンチョビを使用して実験を行うために使用できる、基本的であるが包括的な実験システムの確立を示した。"]
[82,31183663,"animal\n(fish)","large-scale loach (Paramisgurnus dabryanus)","CRISPR;Cas9;","tyrosinase","Transgenic research","Production of a mutant of large-scale loach Paramisgurnus dabryanus with skin pigmentation loss by genome editing with CRISPR/Cas9 system.",2019,"28(3-4):341-356","[Xu X et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei,  China.",31183663,"10.1007/s11248-019-00125-6 ","CRISPR/Cas9 system has been developed as a highly efficient genome editing technology to specifically induce mutations in a few aquaculture species. In this study, we described induction of targeted gene (namely tyrosinase, tyr) mutations in large-scale loach Paramisgurnus dabryanus, an important aquaculture fish species and a potential model organism for studies of intestinal air-breathing function, using the CRISPR/Cas9 system. Tyr gene in large-scale loach was firstly cloned and then its expressions were investigated. Two guide RNAs (gRNAs) were designed and separately transformed with Cas9 in the loach. 89.4% and 96.1% of injected loach juveniles respectively displayed a graded loss of pigmentation for the two gRNAs, in other words, for target 1 and target 2. We classified the injected loach juveniles into five groups according to their skin color phenotypes, including four albino groups and one wild-type-like group. And one of them was clear albino group, which was of high ornamental and commercial value. More than 50 clones for each albino transformant with a visible phenotype in each target were randomly selected and sequenced. Results obtained here showed that along with the increase of pigmentation, wild-type alleles appeared in the injected loach juveniles more often and insertion/deletion alleles less frequently. This study demonstrated that CRISPR/Cas9 system could be practically  performed to modify large-scale loach tyr to produce an albino mutant of high ornamental and commercial value, and for the first time showed successful use of  the CRISPR/Cas9 system for genome editing in a Cobitidae species.","fish","CRISPR / Cas9システムは、いくつかの水産養殖種に突然変異を特異的に誘発するための非常に効率的なゲノム編集技術として開発されました。この研究では、CRISPR / Cas9システムを使用して、重要な水産養殖魚種であり、腸の空気呼吸機能の研究のための潜在的なモデル生物である大規模ドジョウParamisgurnus dabryanusにおける標的遺伝子（すなわちチロシナーゼ、tyr）変異の誘導について説明しました。 。大規模なローチのTyr遺伝子を最初にクローン化し、次にその発現を調べた。2つのガイドRNA（gRNA）が設計され、ローチ内でCas9を使用して別々に形質転換されました。注入されたローチの幼体の89.4％と96.1％は、それぞれ2つのgRNA、つまりターゲット1とターゲット2の色素沈着の段階的な喪失を示しました。注入されたローチの幼体を、4つを含む肌の色の表現型に従って5つのグループに分類しました。アルビノグループと1つの野生型のようなグループ。そしてそれらの1つは、装飾的および商業的価値の高い明確なアルビノグループでした。各ターゲットで表現型が見えるアルビノ形質転換体ごとに50を超えるクローンをランダムに選択し、配列を決定しました。ここで得られた結果は、色素沈着の増加とともに、野生型対立遺伝子が注射されたローチの幼体でより頻繁に現れ、挿入/欠失対立遺伝子がより少ない頻度で現れることを示しました。この研究は、CRISPR / Cas9システムを実際に実行して大規模なドジョウを改変し、装飾的および商業的価値の高いアルビノ変異体を生成できることを示し、初めてCRISPR / Cas9システムをゲノム編集に使用することに成功したことを示しました。ドジョウ科の種。"]
[83,30936180,"animal\n(fish)","medaka","CRISPR;Cas9;","corticotropin-releasing hormone b receptor (crhr1; crhr2)","Development","The central nervous system acts as a transducer of stress-induced masculinization through corticotropin-releasing hormone B.",2019,"146(8)","[Castaneda Cortes DC et al.]","Instituto Tecnologico de Chascomus, INTECH (CONICET-UNSAM), Chascomus, Argentina.",30936180,"10.1242/dev.172866 ","Exposure to environmental stressors, such as high temperature (HT), during early  development of fish induces sex reversal of genotypic females. Nevertheless, the  involvement of the brain in this process is not well clarified. In the present work, we investigated the mRNA levels of corticotropin-releasing hormone b (crhb) and its receptors (crhr1 and crhr2), and found that they were upregulated at HT during the crucial period of gonadal sex determination in medaka. In order to clarify their roles in sex reversal, biallelic mutants for crhr1 and crhr2 were produced by CRISPR/Cas9 technology. Remarkably, biallelic mutants of both loci (crhr1 and crhr2) did not undergo female-to-male sex reversal upon exposure to HT. Inhibition of this process in double corticotropin-releasing hormone receptor mutants could be successfully rescued through the administration of the downstream effector of the hypothalamic-pituitary-interrenal axis, cortisol. Taken together, these results reveal for the first time that the CNS acts as a transducer of masculinization induced by thermal stress.","fish","魚の初期発育中に高温（HT）などの環境ストレッサーにさらされると、遺伝子型の雌の性転換が引き起こされます。それにもかかわらず、このプロセスにおける脳の関与は十分に解明されていません。本研究では、コルチコトロピン放出ホルモンb（crhb）とその受容体（crhr1およびcrhr2）のmRNAレベルを調査し、メダカの性腺性決定の重要な時期にHTでアップレギュレートされることを発見しました。性転換におけるそれらの役割を明らかにするために、crhr1およびcrhr2の2対立遺伝子変異体がCRISPR / Cas9テクノロジーによって生成されました。注目すべきことに、両方の遺伝子座（crhr1とcrhr2）の二対立遺伝子変異体は、HTへの曝露時に女性から男性への性転換を受けませんでした。二重コルチコトロピン放出ホルモン受容体変異体におけるこのプロセスの阻害は、視床下部-下垂体-腎間軸の下流エフェクターであるコルチゾールの投与によって首尾よく救済することができた。まとめると、これらの結果は、CNSが熱ストレスによって誘発される男性化のトランスデューサーとして機能することを初めて明らかにしています。"]
[84,30117276,"animal\n(fish)","medaka","CRISPR;Cas9;","cdkn2ab","Pigment cell & melanoma research","Analysis of the putative tumor suppressor gene cdkn2ab in pigment cells and melanoma of Xiphophorus and medaka.",2019,"32(2):248-258","[Regneri J et al.]","University of Wurzburg, Biozentrum, Wurzburg, Germany.",30117276,"10.1111/pcmr.12729 ","In humans, the CDKN2A locus encodes two transcripts, INK4A and ARF. Inactivation  of either one by mutations or epigenetic changes is a frequent signature of malignant melanoma and one of the most relevant entry points for melanomagenesis. To analyze whether cdkn2ab, the fish ortholog of CDKN2A, has a similar function as its human counterpart, we studied its action in fish models for human melanoma. Overexpression of cdkn2ab in a Xiphophorus melanoma cell line led to decreased proliferation and induction of a senescence-like phenotype, indicating  a melanoma-suppressive function analogous to mammals. Coexpression of Xiphophorus cdkn2ab in medaka transgenic for the mitfa:xmrk melanoma-inducing gene resulted in full suppression of melanoma development, whereas CRISPR/Cas9 knockout of cdkn2ab resulted in strongly enhanced tumor growth. In summary, this provides the first functional evidence that cdkn2ab acts as a potent tumor suppressor gene in  fish melanoma models.","fish","ヒトでは、CDKN2A遺伝子座はINK4AとARFの2つの転写産物をコードしています。突然変異またはエピジェネティックな変化によるいずれかの不活化は、悪性メラノーマの頻繁な兆候であり、メラノーマ形成の最も関連性のあるエントリーポイントの1つです。CDKN2Aの魚のオルソログであるcdkn2abがヒトのオルソログと同様の機能を持っているかどうかを分析するために、ヒト黒色腫の魚モデルにおけるその作用を研究しました。Xiphophorusメラノーマ細胞株におけるcdkn2abの過剰発現は、増殖の低下と老化様表現型の誘導をもたらし、哺乳類に類似したメラノーマ抑制機能を示しています。mitfa：xmrkメラノーマ誘発遺伝子のトランスジェニックメダカにおけるXiphophorus cdkn2abの共発現は、メラノーマ発生の完全な抑制をもたらしましたが、cdkn2abのCRISPR / Cas9ノックアウトは腫瘍増殖を強力に増強しました。要約すると、これは、cdkn2abが魚の黒色腫モデルにおいて強力な腫瘍抑制遺伝子として作用するという最初の機能的証拠を提供します。"]
[85,30845151,"animal\n(fish)","medaka","CRISPR;Cas9;","oca2; pnp4a","PloS one","Enhanced in vivo-imaging in medaka by optimized anaesthesia, fluorescent protein  selection and removal of pigmentation.",2019,"14(3):e0212956","[Lischik CQ et al.]","Heidelberg University, Heidelberg, Germany.",30845151,"10.1371/journal.pone.0212956 ","Fish are ideally suited for in vivo-imaging due to their transparency at early stages combined with a large genetic toolbox. Key challenges to further advance imaging are fluorophore selection, immobilization of the specimen and approaches  to eliminate pigmentation. We addressed all three and identified the fluorophores and anaesthesia of choice by high throughput time-lapse imaging. Our results indicate that eGFP and mCherry are the best conservative choices for in vivo-fluorescence experiments, when availability of well-established antibodies and nanobodies matters. Still, mVenusNB and mGFPmut2 delivered highest absolute fluorescence intensities in vivo. Immobilization is of key importance during extended in vivo imaging. Here, traditional approaches are outperformed by mRNA injection of alpha-Bungarotoxin which allows a complete and reversible, transient immobilization. In combination with fully transparent juvenile and adult fish established by the targeted inactivation of both, oca2 and pnp4a via CRISPR/Cas9-mediated gene editing in medaka we could dramatically improve the state-of-the art imaging conditions in post-embryonic fish, now enabling light-sheet microscopy of the growing retina, brain, gills and inner organs in the absence of side effects caused by anaesthetic drugs or pigmentation.","fish","魚は、大きな遺伝子ツールボックスと組み合わされた初期段階での透明性のため、invivoイメージングに最適です。イメージングをさらに進歩させるための重要な課題は、フルオロフォアの選択、標本の固定化、および色素沈着を排除するためのアプローチです。3つすべてに取り組み、ハイスループットタイムラプスイメージングによって、選択したフルオロフォアと麻酔を特定しました。私たちの結果は、十分に確立された抗体とナノボディの可用性が重要である場合、eGFPとmCherryがinvivo蛍光実験のための最良の保守的な選択であることを示しています。それでも、mVenusNBとmGFPmut2はinvivoで最高の絶対蛍光強度を示しました。固定化は、拡張されたinvivoイメージング中に非常に重要です。ここでは、従来のアプローチは、完全かつ可逆的な一過性の固定化を可能にするアルファ-ブンガロトキシンのmRNA注入よりも優れています。メダカでのCRISPR / Cas9を介した遺伝子編集を介したoca2とpnp4aの両方の標的不活化によって確立された完全に透明な幼魚と成魚と組み合わせることで、胚後魚の最先端のイメージング条件を劇的に改善することができました。麻酔薬や色素沈着による副作用がなく、成長中の網膜、脳、鰓、内臓のライトシート顕微鏡検査を可能にします。"]
[86,30871638,"animal\n(fish)","medaka (Japanese killifish, Oryzias latipes)","CRISPR;Cas9;","H3K27 methyltranferase Ezh2; dCas9; H2K27me3","Epigenetics & chromatin","Targeted in vivo epigenome editing of H3K27me3.",2019,"12(1):17","[Fukushima HS et al.]","University of  Tokyo, Tokyo, Japan.",30871638,"10.1186/s13072-019-0263-z ","BACKGROUND: Epigenetic modifications have a central role in transcriptional regulation. While several studies using next-generation sequencing have revealed  genome-wide associations between epigenetic modifications and transcriptional states, a direct causal relationship at specific genomic loci has not been fully  demonstrated, due to a lack of technology for targeted manipulation of epigenetic modifications. Recently, epigenome editing techniques based on the CRISPR-Cas9 system have been reported to directly manipulate specific modifications at precise genomic regions. However, the number of editable modifications as well as studies applying these techniques in vivo is still limited. RESULTS: Here, we report direct modification of the epigenome in medaka (Japanese killifish, Oryzias latipes) embryos. Specifically, we developed a method to ectopically induce the repressive histone modification, H3K27me3 in a locus-specific manner,  using a fusion construct of Oryzias latipes H3K27 methyltransferase Ezh2 (olEzh2) and dCas9 (dCas9-olEzh2). Co-injection of dCas9-olEzh2 mRNA with single guide RNAs (sgRNAs) into one-cell-stage embryos induced specific H3K27me3 accumulation  at the targeted loci and induced downregulation of gene expression. CONCLUSION: In this study, we established the in vivo epigenome editing of H3K27me3 using medaka embryos. The locus-specific manipulation of the epigenome in living organisms will lead to a previously inaccessible understanding of the role of epigenetic modifications in development and disease.","fish","背景：エピジェネティック修飾は、転写調節において中心的な役割を果たします。次世代シーケンシングを使用したいくつかの研究により、エピジェネティック修飾と転写状態の間のゲノム全体の関連性が明らかになりましたが、エピジェネティック修飾のターゲット操作の技術が不足しているため、特定のゲノム遺伝子座での直接的な因果関係は完全には実証されていません。最近、CRISPR-Cas9システムに基づくエピゲノム編集技術が正確なゲノム領域で特定の修飾を直接操作することが報告されています。ただし、編集可能な変更の数と、これらの手法をinvivoで適用する研究はまだ限られています。結果：ここでは、メダカ（メダカ、Oryzias latipes）胚のエピゲノムの直接修飾を報告します。具体的には、Oryzias latipes H3K27メチルトランスフェラーゼEzh2（olEzh2）とdCas9（dCas9-olEzh2）の融合コンストラクトを使用して、抑制性ヒストン修飾H3K27me3を遺伝子座特異的に異所的に誘導する方法を開発しました。dCas9-olEzh2 mRNAとシングルガイドRNA（sgRNA）を1細胞期の胚に同時注入すると、標的遺伝子座に特異的なH3K27me3の蓄積が誘導され、遺伝子発現のダウンレギュレーションが誘導されました。結論：この研究では、メダカ胚を使用したH3K27me3のinvivoエピゲノム編集を確立しました。生物におけるエピゲノムの遺伝子座特異的操作は、発達と疾患におけるエピジェネティックな修飾の役割についての以前はアクセスできなかった理解につながります。"]
[87,30835740,"animal\n(fish)","medaka (Oryzias latipes); zebrafish (Danio rerio) ","CRISPR;Cas9;"," ","PloS one","Swift Large-scale Examination of Directed Genome Editing.",2019,"14(3):e0213317","[Hammouda OT et al.]","Heidelberg University, Heidelberg, Germany.",30835740,"10.1371/journal.pone.0213317 ","In the era of CRISPR gene editing and genetic screening, there is an increasing demand for quick and reliable nucleic acid extraction pipelines for rapid genotyping of large and diverse sample sets. Despite continuous improvements of current workflows, the handling-time and material costs per sample remain major limiting factors. Here we present a robust method for low-cost DIY-pipet tips addressing these needs; i.e. using a cellulose filter disc inserted into a regular pipet tip. These filter-in-tips allow for a rapid, stand-alone four-step  genotyping workflow by simply binding the DNA contained in the primary lysate to  the cellulose filter, washing it in water and eluting it directly into the buffer for the downstream application (e.g. PCR). This drastically cuts down processing  time to maximum 30 seconds per sample, with the potential for parallelizing and automation. We show the ease and sensitivity of our procedure by genotyping genetically modified medaka (Oryzias latipes) and zebrafish (Danio rerio) embryos (targeted by CRISPR/Cas9 knock-out and knock-in) in a 96-well plate format. The robust isolation and detection of multiple alleles of various abundancies in a mosaic genetic background allows phenotype-genotype correlation already in the injected generation, demonstrating the reliability and sensitivity of the protocol. Our method is applicable across kingdoms to samples ranging from cells  to tissues i. e. plant seedlings, adult flies, mouse cell culture and tissue as well as adult fish fin-clips.","fish","CRISPR遺伝子編集と遺伝子スクリーニングの時代では、大規模で多様なサンプルセットの迅速な遺伝子型決定のための迅速で信頼性の高い核酸抽出パイプラインに対する需要が高まっています。現在のワークフローは継続的に改善されていますが、サンプルあたりの処理時間と材料費は依然として主要な制限要因です。ここでは、これらのニーズに対応する低コストのDIYピペットチップの堅牢な方法を紹介します。つまり、通常のピペットチップに挿入されたセルロースフィルターディスクを使用します。これらのフィルターインチップにより、一次ライセートに含まれるDNAをセルロースフィルターに結合し、水で洗浄し、下流のアプリケーション用のバッファーに直接溶出するだけで、迅速なスタンドアロンの4ステップのジェノタイピングワークフローが可能になります（例：PCR）。これにより、処理時間がサンプルあたり最大30秒に大幅に短縮され、並列化と自動化の可能性があります。遺伝子組み換えメダカ（Oryzias latipes）とゼブラフィッシュ（Daniorerio）の胚（CRISPR / Cas9ノックアウトとノックインの対象）を96ウェルプレートフォーマットでジェノタイピングすることにより、手順の容易さと感度を示します。モザイクの遺伝的背景におけるさまざまな存在量の複数の対立遺伝子の堅牢な分離と検出により、注入された世代ですでに表現型と遺伝子型の相関が可能になり、プロトコルの信頼性と感度が実証されます。私たちの方法は、細胞から組織、すなわち植物の実生、成虫のハエ、マウスの細胞培養および組織、ならびに成体の魚のヒレクリップに至るまでのサンプルに、王国を越えて適用可能です。"]
[88,31837141,"animal\n(fish)","nile tilapia","CRISPR;Cas9;","foxh1","Biology of reproduction","Homozygous mutation of foxh1 arrests oogenesis causing infertility in female Nile tilapia.",2019,null,"[Tao W et al.]","Guangdong Ocean University, Zhanjiang, China.",31837141,"10.1093/biolre/ioz225 ","Foxh1, a member of fox gene family, was first characterized as a transcriptional  partner in the formation of the Smad protein complex. Recent studies have shown foxh1 is highly expressed in the cytoplasm of oocytes in both tilapia and mouse.  However, its function in oogenesis remains unexplored. In the present study, foxh1-/- tilapia was created by CRISPR/Cas9. At 180 dah (days after hatching), the foxh1-/- XX fish showed oogenesis arrest and a significantly lower GSI. The transition of oocytes from phase II to phase III and follicle cells from one to two layers was blocked, resulting in infertility of the mutant. Transcriptomic analysis revealed that expression of genes involved in estrogen synthesis and oocyte growth were altered in the foxh1-/- ovaries. Loss of foxh1 resulted in significantly decreased Cyp19a1a and increased Cyp11b2 expression, consistent with significantly lower concentrations of serum estradiol-17beta (E2) and higher concentrations of 11-Ketotestosterone (11-KT). Moreover, administration of E2 rescued the phenotypes of foxh1-/- XX fish, as indicated by the appearance of phase III and IV oocytes and absence of Cyp11b2 expression. Taken together, these results suggest that foxh1 functions in the oocytes to regulate oogenesis by promoting cyp19a1a expression, and therefore estrogen production. Disruption of foxh1 may block the estrogen synthesis and oocyte growth, leading to the arrest of oogenesis and thus infertility in tilapia.","fish","Fox遺伝子ファミリーのメンバーであるFoxh1は、Smadタンパク質複合体の形成における転写パートナーとして最初に特徴づけられました。最近の研究では、foxh1はティラピアとマウスの両方の卵母細胞の細胞質で高度に発現していることが示されています。ただし、oogenesisでのその機能は未踏のままです。本研究では、foxh1-/-tilapiaはCRISPR / Cas9によって作成されました。180 dah（孵化後の日数）で、foxh1-/-XX魚は卵形成停止と有意に低いGSIを示しました。卵母細胞のフェーズIIからフェーズIIIへの移行、および卵胞細胞の1層から2層への移行がブロックされ、変異体の不妊が生じました。トランスクリプトーム解析により、エストロゲン合成と卵母細胞の成長に関与する遺伝子の発現がfoxh1-/-卵巣で変化していることが明らかになりました。foxh1が失われると、Cyp19a1aが大幅に減少し、Cyp11b2の発現が増加しました。これは、血清エストラジオール-17ベータ（E2）の濃度が大幅に低く、11-ケトテストステロン（11-KT）の濃度が高いことと一致しています。さらに、E2の投与は、フェーズIIIおよびIVの卵母細胞の出現と、Cyp11b2の発現の欠如によって示されるように、foxh1-/-XX魚の表現型を救済しました。まとめると、これらの結果は、foxh1が卵母細胞で機能し、cyp19a1aの発現、したがってエストロゲン産生を促進することによって卵形成を調節することを示唆しています。foxh1の破壊は、エストロゲン合成と卵母細胞の成長をブロックし、卵形成の停止、ひいてはティラピアの不妊症につながる可能性があります。"]
[89,31078694,"animal\n(fish)","nile tilapia","CRISPR;Cas9;","esr1; esr2a; esr2b","Journal of steroid biochemistry and molecular biology","Establishment of three estrogen receptors (esr1, esr2a, esr2b) knockout lines for functional study in Nile tilapia.",2019,"191:105379","[Yan L et al.]","Southwest University, Chongqing, China.",31078694,"10.1016/j.jsbmb.2019.105379 ","Estrogens play fundamental roles in regulating reproductive activities and they act through estrogen receptors (ESRs) in all vertebrates. To date, distinct roles of estrogen receptors have been characterized only in human and model organisms,  including mouse, rat, zebrafish and medaka. Physiological role of estrogen/receptor signaling in reproduction remains poorly defined in non-model organisms. In the present study, we successfully generated esr1, esr2a and esr2b  mutant lines in tilapia by CRISPR/Cas9 and examined their phenotypes. Surprisingly, the esr1 mutants showed no phenotypes of reproductive development and function in both females and males. The esr2a mutant females showed significantly delayed ovarian development and follicle growth at 90 and 180 dah,  and the development caught up later at 360 dah. The esr2a mutant males showed no  phenotypes at 90 dah, and displayed smaller gonads and efferent ducts, less spermatogonia and more abnormal sperms at 180 dah. In contrast, the esr2b mutants displayed abnormal development of ovarian ducts and efferent ducts which failed to connect to the genital orifice, and which in turn, resulted in infertility in  female and male, respectively, although they produced gametes in their gonads. Taken together, our study provides evidence for differential functions of esr1, esr2a and esr2b in fish reproduction.","fish","エストロゲンは生殖活動の調節に基本的な役割を果たし、すべての脊椎動物のエストロゲン受容体（ESR）を介して作用します。今日まで、エストロゲン受容体の明確な役割は、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、メダカなどのヒトおよびモデル生物でのみ特徴づけられてきました。生殖におけるエストロゲン/受容体シグナル伝達の生理学的役割は、非モデル生物では十分に定義されていないままです。本研究では、CRISPR / Cas9によりティラピアでesr1、esr2a、esr2b変異株の生成に成功し、それらの表現型を調べました。驚いたことに、esr1変異体は、雌雄の両方で生殖発達と機能の表現型を示さなかった。esr2a変異体の雌は、90および180 dahで卵巣の発達と濾胞の成長が著しく遅延し、その後360dahで発達が追いついた。esr2a変異体の男性は、90 dahで表現型を示さず、180 dahでより小さな生殖腺と排出管、より少ない精子とより多くの異常な精子を示しました。対照的に、esr2b変異体は、生殖器の開口部に接続できなかった卵巣管と排出管の異常な発達を示し、その結果、性腺に配偶子を生成したものの、それぞれ女性と男性に不妊症をもたらしました。一緒に取られて、私たちの研究は魚の繁殖におけるesr1、esr2aおよびesr2bの異なる機能の証拠を提供します。"]
[90,31678357,"animal\n(fish)","Nile tilapia (Oreochromis niloticus)","CRISPR;Cas9;","relaxin3","Journal of steroid biochemistry and molecular biology","Rln3a is a prerequisite for spermatogenesis and fertility in male fish.",2019,"197:105517","[Yang L et al.]","Southwest University, Chongqing, China.",31678357,"10.1016/j.jsbmb.2019.105517 ","The essential roles of Relaxin3 (RLN3) in energy homeostasis had been well investigated, while the mechanisms of RLN3 regulating reproduction remain to be elusive in mammals. Although two rln3 paralogues have been characterized in several teleosts, their functions still remain largely unknown. In this study, two paralogous rln3 genes, represented as rln3a and rln3b, were identified from the testis of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Rln3a was dominantly expressed in testis, while the most abundant rln3b expression was in brain. In situ hybridization demonstrated that rln3a is abundantly expressed in the Leydig  cells of the testis. To understand the role of Rln3 in the testicular development, homologous null-rln3a gene mutant line was constructed by CRISPR/Cas9 technology. Morphological observation demonstrated that null mutation of rln3a gene caused testicular hypertrophy and a significant increase of GSI. However, a significant decrease of spermatogenic cells at different phases, i.e.  spermatogonia, spermatocytes, spermatids and sperms was found. Silencing of rln3a gene repressed the expression of key genes in germ cell and Leydig cell. Deficiency of Rln3a led to the significant decrease of 11-KT production, which stimulated the up-regulation of both FSH and LH production in the pituitary via a negative feedback manner possibly. Mutation of rln3a in XY fish led to the hypogonadism with sperm deformation, significant decrease of fertility, and sperm motility, revealing as the high mortality of the offspring obtained by crossing the wild type female and rln3a(-/-) XY fish. Interestingly, recombinant human RLN3 injection significantly enhanced the sperm motility in rln3a(-/-) XY fish. Moreover, hCG treatment stimulated the expression of steroidogenic enzyme genes and 11-KT production, which were repressed by rln3a mutation in XY fish. Taken together, this study, for the first time by using a gene knockout model, proved that Rln3a is an indispensable mediator for androgen production in testis via HPG axis, and plays an essential role in spermatogenesis, sperm motility and male fertility in fish.","fish","エネルギー恒常性におけるRelaxin3（RLN3）の重要な役割は十分に調査されていますが、RLN3が生殖を調節するメカニズムは哺乳類ではとらえどころのないままです。2つのrln3パラログがいくつかのテレオストで特徴付けられていますが、それらの機能はまだほとんど不明のままです。この研究では、rln3aおよびrln3bとして表される2つのパラロガスrln3遺伝子が、ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）の精巣から同定されました。Rln3aは主に精巣で発現しましたが、最も豊富なrln3bの発現は脳でした。インサイチュハイブリダイゼーションは、rln3aが精巣のレイディグ細胞で豊富に発現されることを示した。精巣の発達におけるRln3の役割を理解するために、CRISPR / Cas9テクノロジーによって相同なnull-rln3a遺伝子変異株を構築しました。形態学的観察は、rln3a遺伝子のヌル変異が精巣肥大とGSIの有意な増加を引き起こしたことを示した。しかし、異なる段階、すなわち精原細胞、精母細胞、精子細胞および精子での精子形成細胞の有意な減少が見られた。rln3a遺伝子のサイレンシングは、生殖細胞とライディッヒ細胞における重要な遺伝子の発現を抑制しました。Rln3aの欠乏は、11-KT産生の有意な減少をもたらし、それはおそらく負のフィードバック様式を介して下垂体におけるFSHと​​LHの両方の産生のアップレギュレーションを刺激しました。XY魚のrln3aの変異は、精子の変形、生殖能力の有意な低下、精子の運動性を伴う性腺機能低下症を引き起こし、野生型の雌とrln3a（-/-）XY魚を交配することによって得られた子孫の高い死亡率として明らかになりました。興味深いことに、組換えヒトRLN3注射は、rln3a（-/-）XY魚の精子運動性を有意に増強しました。さらに、hCG処理は、ステロイド産生酵素遺伝子の発現と11-KT産生を刺激し、XY魚のrln3a変異によって抑制されました。まとめると、この研究は、遺伝子ノックアウトモデルを使用して初めて、Rln3aがHPG軸を介した精巣でのアンドロゲン産生に不可欠なメディエーターであり、魚の精子形成、精子運動性、および男性の生殖能力に不可欠な役割を果たすことを証明しました。"]
[91,31353167,"animal\n(fish)","pufferfish","CRISPR;Cas9;","ectodysplastin","iScience","Evolution and Developmental Diversity of Skin Spines in Pufferfishes.",2019,"19:1248-1259","[Shono T et al.]","University of Sheffield, Sheffield, UK.",31353167,"10.1016/j.isci.2019.06.003 ","Teleost fishes develop remarkable varieties of skin ornaments. The developmental  basis of these structures is poorly understood. The order Tetraodontiformes includes diverse fishes such as the ocean sunfishes, triggerfishes, and pufferfishes, which exhibit a vast assortment of scale derivatives. Pufferfishes  possess some of the most extreme scale derivatives, dermal spines, erected during their characteristic puffing behavior. We demonstrate that pufferfish scale-less  spines develop through conserved gene interactions that underlie general vertebrate skin appendage formation, including feathers and hair. Spine development retains conservation of the EDA (ectodysplasin) signaling pathway, important for the development of diverse vertebrate skin appendages, including these modified scale-less spines of pufferfish. Further modification of genetic signaling from both CRISPR-Cas9 and small molecule inhibition leads to loss or reduction of spine coverage, providing a mechanism for skin appendage diversification observed throughout the pufferfishes. Pufferfish spines have evolved broad variations in body coverage, enabling adaptation to diverse ecological niches.","fish","Teleostの魚は、驚くべき種類の皮膚装飾品を開発します。これらの構造の発達上の基礎はよくわかっていません。フグ目には、マンボウ、モンガラカワハギ、フグなど、さまざまな種類の鱗の派生物を示す多様な魚が含まれます。フグは、特徴的なフグの行動中に建てられた、最も極端な規模の派生物である真皮の棘を持っています。我々は、フグの鱗のない棘が、羽や髪を含む一般的な脊椎動物の皮膚付属器形成の根底にある保存された遺伝子相互作用を通じて発達することを示しています。脊椎の発達は、EDA（エクトジスプラシン）シグナル伝達経路の保存を保持します。これは、フグのこれらの改変された鱗のない棘を含む、多様な脊椎動物の皮膚付属肢の発達に重要です。CRISPR-Cas9と小分子阻害の両方からの遺伝子シグナル伝達のさらなる変更は、脊椎被覆の喪失または減少につながり、フグ全体で観察される皮膚付属肢の多様化のメカニズムを提供します。フグの棘は、体の範囲に幅広いバリエーションを進化させ、多様な生態学的ニッチへの適応を可能にしています。"]
[92,30482801,"animal\n(fish)","tilapia","CRISPR;Cas9;","non-coding sequences including microRNA and 3' untranslated region","G3","High Efficiency Targeting of Non-coding Sequences Using CRISPR/Cas9 System in Tilapia.",2019,"9(1):287-295","[Li M et al.]","Southwest University, Chongqing, China.",30482801,"10.1534/g3.118.200883 ","The CRISPR/Cas9 has been successfully applied for disruption of protein coding sequences in a variety of organisms. The majority of the animal genome is actually non-coding sequences, which are key regulators associated with various biological processes. In this study, to understand the biological significance of these sequences, we used one or dual gRNA guided Cas9 nuclease to achieve specific deletion of non-coding sequences including microRNA and 3' untranslated  region (UTR) in tilapia, which is an important fish for studying sex determination and evolution. Co-injection of fertilized eggs with single gRNA targeting seed region of miRNA and Cas9 mRNA resulted in indel mutations. Further, co-injection of fertilized eggs with dual gRNAs and Cas9 mRNA led to the removal of the fragment between the two target loci, yielding maximum efficiency  of 11%. This highest genomic deletion efficiency was further improved up to 19% using short ssDNA as a donor. The deletions can be transmitted through the germline to the next generation at average efficiency of 8.7%. Cas9-vasa 3'-UTR was used to increase the efficiency of germline transmission of non-coding sequence deletion up to 14.9%. In addition, the 3'-UTR of the vasa gene was successfully deleted by dual gRNAs. Deletion of vasa 3'-UTR resulted in low expression level of vasa mRNA in the gonad when compared with the control. To summarize, the improved CRISPR/Cas9 system provided a powerful platform that can  assist to easily generate desirable non-coding sequences mutants in non-model fish tilapia to discovery their functions.","fish","CRISPR / Cas9は、さまざまな生物のタンパク質コード配列の破壊にうまく適用されています。動物ゲノムの大部分は実際には非コード配列であり、さまざまな生物学的プロセスに関連する重要な調節因子です。この研究では、これらの配列の生物学的重要性を理解するために、1つまたはデュアルのgRNA誘導Cas9ヌクレアーゼを使用して、マイクロRNAおよび3 '非翻訳領域（UTR）を含む非コード配列の特異的欠失を達成しました。性の決定と進化を研究する。miRNAのシード領域とCas9mRNAを標的とする単一のgRNAを受精卵に同時注入すると、インデル変異が生じました。さらに、受精卵とデュアルgRNAおよびCas9 mRNAの同時注入により、2つの標的遺伝子座間のフラグメントが除去され、最大効率が11％になりました。この最高のゲノム削除効率は、ドナーとして短いssDNAを使用して最大19％までさらに改善されました。欠失は、平均効率8.7％で生殖細胞系を介して次世代に伝達することができます。Cas9-vasa 3'-UTRを使用して、非コード配列欠失の生殖細胞系伝達の効率を最大14.9％向上させました。さらに、vasa遺伝子の3'-UTRはデュアルgRNAによって正常に削除されました。vasa 3'-UTRの削除は、コントロールと比較した場合、性腺におけるvasamRNAの低い発現レベルをもたらしました。要約すると、改良されたCRISPR / Cas9システムは、非モデルの魚のティラピアで望ましい非コード配列変異体を簡単に生成してその機能を発見するのに役立つ強力なプラットフォームを提供しました。"]
[93,31710047,"animal\n(fish)","weakly electric fish (mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio)","CRISPR;Cas9;","sodium channel gene (scn4aa)","Journal of visualized experiments","Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish.",2019,"(152)","[Constantinou SJ et al.]","Michigan State University, MI, USA.",31710047,"10.3791/60253 ","Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric  fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.","fish","脊椎動物の進化の歴史において、電気受容と電気発生は変化しました。共通の遺伝的構造を共有するこれらの独立して派生した表現型には、驚くべき程度の収束があります。これはおそらく、弱い電界を生成および検出し、弱い電界の魚と呼ばれる、種が豊富な2つのテレオストクレードである体育館とモルミリドの多数の収束機能によって最もよく例証されます。弱電気の魚が周囲を感知して通信するために電気を使用するという発見から50年間で、科学者の成長するコミュニティは、開発、システムと回路の神経科学、細胞生理学、生態学、進化生物学、および行動の進化について途方もない洞察を得てきました。最近では、電気魚のゲノムリソースが急増しています。これらのリソースの使用は、これらの種の遺伝子型と表現型の関係に関する重要な洞察をすでに促進しています。ゲノミクスデータを弱電気魚の表現型データと統合することへの主な障害は、機能ゲノミクスツールの現在の欠如です。ここでは、弱電気魚の内因性DNA修復メカニズムを利用するCRISPR / Cas9突然変異誘発を実行するための完全なプロトコルを報告します。このプロトコルは、CRISPR / Cas9を使用してナトリウムチャネル遺伝子scn4aaの最初のエキソンのインデルとポイント変異をターゲットにすることにより、モルミリド種Brienomyrusbrachyistiusと体育館型Brachyhypopomusgauderioの両方で同等に効果的であることを示します。このプロトコルを使用して、両方の種からの胚を取得し、遺伝子型を特定して、ナトリウムチャネルscn4aaの最初のエクソンに予測される変異が存在することを確認しました。ノックアウト成功の表現型は、注入されていないサイズが一致するコントロールと比較した場合、電気器官の放電振幅の減少を示す記録で確認されました。"]
[94,30593611,"animal\n(fish)","white crucian carp (Carassius auratus cuvieri, WCC); WWC-red crucian carp hybrid","CRISPR;Cas9;","tyrosinase","Science China. Life sciences","Targeted disruption of tyrosinase causes melanin reduction in Carassius auratus cuvieri and its hybrid progeny.",2019,"62(9):1194-1202","[Liu Q et al.]","Hunan Normal University, Changsha, China.",30593611,"10.1007/s11427-018-9404-7 ","The white crucian carp (Carassius auratus cuvieri, WCC) not only is one of the most economically important fish in Asia, characterized by strong reproductive ability and rapid growth rates, but also represents a good germplasm to produce hybrid progenies with heterosis. Gene knockout technique provides a safe and acceptant way for fish breeding. Achieving gene knockout in WCC and its hybrid progeny will be of great importance for both genetic studies and hybridization breeding. Tyrosinase (TYR) is a key enzyme in melanin synthesis. Depletion of tyr in zebrafish and mice results in mosaic pigmentation or total albinism. Here, we  successfully used CRISPR-Cas9 to target tyr in WCC and its hybrid progeny (WR) derived from the cross of WCC (female symbol) and red crucian carp (Carassius auratus red var., RCC, male symbol). The level of TYR protein was significantly reduced in mutant WCC. Both the mutant WCC and the mutant WR showed different degrees of melanin reduction compared with the wild-type sibling control fish, resulting from different mutation efficiency ranging from 60% to 90%. In addition, the transcriptional expression profiles of a series of pivotal pigment  synthesis genes, i.e. tyrp1, mitfa, mitfb, dct and sox10, were down-regulated in  tyr-CRISPR WCC, which ultimately caused a reduction in melanin synthesis. These results demonstrated that tyr plays a key role in melanin synthesis in WCC and WR, and CRISPR-Cas9 is an effective tool for modifying the genome of economical fish. Furthermore, the tyr-CRISPR models could be valuable in understanding fundamental mechanisms of pigment formation in non-model fish.","fish","ゲンゴロウブナ（Carassius auratus cuvieri、WCC）は、アジアで最も経済的に重要な魚の1つであり、強い繁殖能力と急速な成長率を特徴とするだけでなく、雑種強勢を伴う雑種強勢を生み出す優れた遺伝資源でもあります。遺伝子ノックアウト技術は、魚の繁殖のための安全で受け入れられる方法を提供します。WCCとそのハイブリッド子孫で遺伝子ノックアウトを達成することは、遺伝子研究とハイブリダイゼーション育種の両方にとって非常に重要です。チロシナーゼ（TYR）は、メラニン合成の重要な酵素です。ゼブラフィッシュとマウスのtyrの枯渇は、モザイク色素沈着または完全な白皮症をもたらします。ここでは、CRISPR-Cas9を使用して、WCC（女性のシンボル）と赤い十字軍の鯉（Carassius auratus red var。、RCC、男性のシンボル）の交配から派生したWCCとそのハイブリッド子孫（WR）のtyrをターゲットにすることに成功しました。TYRタンパク質のレベルは変異体WCCで有意に減少しました。突然変異体WCCと突然変異体WRの両方が、野生型の兄弟対照魚と比較して異なる程度のメラニン減少を示しました。これは、60％から90％の範囲の異なる突然変異効率に起因します。さらに、一連の極めて重要な色素合成遺伝子、すなわちtyrp1、mitfa、mitfb、dct、およびsox10の転写発現プロファイルは、tyr-CRISPR WCCでダウンレギュレートされ、最終的にメラニン合成の低下を引き起こしました。これらの結果は、tyrがWCCおよびWRでのメラニン合成に重要な役割を果たしていることを示しており、CRISPR-Cas9は経済的な魚のゲノムを改変するための効果的なツールです。さらに、tyr-CRISPRモデルは、非モデル魚の色素形成の基本的なメカニズムを理解するのに役立つ可能性があります。"]
[95,30609410,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","ncapg2; nphp1","American journal of human genetics","Mutations in NCAPG2 Cause a Severe Neurodevelopmental Syndrome that Expands the Phenotypic Spectrum of Condensinopathies.",2019,"104(1):94-111","[Khan TN et al.]","Duke University, Durham, NC, USA.",30609410,"10.1016/j.ajhg.2018.11.017 ","The use of whole-exome and whole-genome sequencing has been a catalyst for a genotype-first approach to diagnostics. Under this paradigm, we have implemented  systematic sequencing of neonates and young children with a suspected genetic disorder. Here, we report on two families with recessive mutations in NCAPG2 and  overlapping clinical phenotypes that include severe neurodevelopmental defects, failure to thrive, ocular abnormalities, and defects in urogenital and limb morphogenesis. NCAPG2 encodes a member of the condensin II complex, necessary for the condensation of chromosomes prior to cell division. Consistent with a causal  role for NCAPG2, we found abnormal chromosome condensation, augmented anaphase chromatin-bridge formation, and micronuclei in daughter cells of proband skin fibroblasts. To test the functional relevance of the discovered variants, we generated an ncapg2 zebrafish model. Morphants displayed clinically relevant phenotypes, such as renal anomalies, microcephaly, and concomitant increases in apoptosis and altered mitotic progression. These could be rescued by wild-type but not mutant human NCAPG2 mRNA and were recapitulated in CRISPR-Cas9 F0 mutants. Finally, we noted that the individual with a complex urogenital defect also harbored a heterozygous NPHP1 deletion, a common contributor to nephronophthisis. To test whether sensitization at the NPHP1 locus might contribute to a more severe renal phenotype, we co-suppressed nphp1 and ncapg2, which resulted in significantly more dysplastic renal tubules in zebrafish larvae. Together, our data suggest that impaired function of NCAPG2 results in a  severe condensinopathy, and they highlight the potential utility of examining candidate pathogenic lesions beyond the primary disease locus.","fish","全エクソームおよび全ゲノムシーケンスの使用は、診断への遺伝子型優先アプローチの触媒となっています。このパラダイムの下で、遺伝性疾患が疑われる新生児と幼児の体系的なシーケンスを実装しました。ここでは、NCAPG2の劣性突然変異と、重度の神経発達障害、成長障害、眼の異常、泌尿生殖器および四肢の形態形成の欠陥を含む重複する臨床表現型を持つ2つの家族について報告します。NCAPG2は、細胞分裂前の染色体の凝縮に必要なコンデンシンII複合体のメンバーをエンコードします。NCAPG2の原因となる役割と一致して、発端者の皮膚線維芽細胞の娘細胞に異常な染色体凝縮、後期クロマチンブリッジ形成の増大、および小核が見られました。発見されたバリアントの機能的関連性をテストするために、ncapg2ゼブラフィッシュモデルを生成しました。モルファントは、腎異常、小頭蓋症、それに伴うアポトーシスの増加、有糸分裂の進行の変化など、臨床的に関連する表現型を示しました。これらは、野生型ではなく変異型のヒトNCAPG2 mRNAによって救出され、CRISPR-Cas9F0変異体で再現されました。最後に、複雑な泌尿生殖器の欠陥を持つ個人は、ネフロン癇の一般的な原因であるヘテロ接合性のNPHP1欠失も抱えていることに気づきました。NPHP1遺伝子座での感作がより重篤な腎表現型に寄与するかどうかをテストするために、nphp1とncapg2を共抑制しました。これにより、ゼブラフィッシュの幼生で著しく多くの形成異常腎尿細管が生じました。一緒に、私たちのデータは、NCAPG2の機能障害が重度の凝縮症を引き起こすことを示唆しており、原発性疾患の遺伝子座を超えて候補となる病原性病変を調べることの潜在的な有用性を強調しています。"]
[96,30851936,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","zip6","Biochemical and biophysical research communications","SLC39A6/ZIP6 is essential for zinc homeostasis and T-cell development in zebrafish.",2019,"511(4):896-902","[Zhao L et al.]","Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China.",30851936,"10.1016/j.bbrc.2019.02.148 ","Zinc (Zn) is an essential trace element that modulate innate and acquired immune  responses, and its deficiency triggers lymphopenia. However, the precise mechanisms underlying zinc-mediated lymphocyte maintenance have not been well clarified. Here, we have successfully generated a zip6-null mutant zebrafish line using TALENs. The Zip6-null mutant zebrafish developed normally during gastrulation. Loss of zip6 in zebrafish resulted in significant T lymphocyte reduction and a decrease in intracellular Zn levels. And the zip6 deficiency increases caspase-related cell apoptosis in both zebrafish cells and human T cells. Our results suggest that ZIP6 plays a critical part in T cell development, and enhance our understanding of Zn homeostasis and immune system maintenance.","fish","亜鉛（Zn）は、先天性および後天性の免疫応答を調節する必須の微量元素であり、その欠乏はリンパ球減少症を引き起こします。ただし、亜鉛を介したリンパ球の維持の根底にある正確なメカニズムは十分に解明されていません。ここでは、TALENを使用してzip6-null変異ゼブラフィッシュラインを正常に生成しました。Zip6-null変異ゼブラフィッシュは原腸陥入中に正常に発達しました。ゼブラフィッシュでzip6が失われると、Tリンパ球が大幅に減少し、細胞内Znレベルが低下しました。また、zip6の欠損は、ゼブラフィッシュ細胞とヒトT細胞の両方でカスパーゼ関連細胞のアポトーシスを増加させます。私たちの結果は、ZIP6がT細胞の発達に重要な役割を果たし、Znホメオスタシスと免疫系の維持についての理解を深めることを示唆しています。"]
[97,30684641,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","photoreceptor cell-specific nuclear receptor gene (Nr2e3)","Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease","Knockout of Nr2e3 prevents rod photoreceptor differentiation and leads to selective L-/M-cone photoreceptor degeneration in zebrafish.",2019,"1865(6):1273-1283","[Xie S et al.]","Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Hubei, China.",30684641,"10.1016/j.bbadis.2019.01.022 ","Mutations in the photoreceptor cell-specific nuclear receptor gene Nr2e3 increased the number of S-cone photoreceptors in human and murine retinas and led to retinal degeneration that involved photoreceptor and non-photoreceptor cells.  The mechanisms underlying these complex phenotypes remain unclear. In the hope of understanding the precise role of Nr2e3 in photoreceptor cell fate determination  and differentiation, we generated a line of Nr2e3 knockout zebrafish using CRISPR technology. In these Nr2e3-null animals, rod precursors undergo terminal mitoses  but fail to differentiate as rods. Rod-specific genes are not expressed and the outer segment (OS) fails to form. Formation and differentiation of cone photoreceptors is normal. Specifically, there is no increase in the number of UV-cone or S-cone photoreceptors. Laminated retinal structure is maintained. After normal development, L-/M-cones selectively degenerate, with progressive shortening of OS that starts at age 1month. The amount of cone phototransduction  proteins is concomitantly reduced, whereas UV- and S-cones have normal OS lengths even at age 10months. In vitro studies show Nr2e3 synergizes with Crx and Nrl to  enhance rhodopsin gene expression. Nr2e3 does not affect cone opsin expression. Our results extend the knowledge of Nr2e3's roles and have specific implications  for the interpretation of the phenotypes observed in human and murine retinas. Furthermore, our model may offer new opportunities in finding treatments for enhanced S-cone syndrome (ESCS) and other retinal degenerative diseases.","fish","光受容体細胞特異的核受容体遺伝子Nr2e3の変異は、ヒトおよびマウスの網膜におけるSコーン光受容体の数を増加させ、光受容体および非光受容体細胞が関与する網膜変性を引き起こした。これらの複雑な表現型の根底にあるメカニズムは不明なままです。光受容細胞の運命決定と分化におけるNr2e3の正確な役割を理解することを期待して、CRISPRテクノロジーを使用してNr2e3ノックアウトゼブラフィッシュのラインを生成しました。これらのNr2e3-null動物では、桿体前駆体は終末有糸分裂を起こしますが、桿体として分化することはできません。ロッド固有の遺伝子は発現せず、外側のセグメント（OS）は形成されません。錐体視細胞の形成と分化は正常です。具体的には、UV錐体またはS錐体光受容体の数の増加はありません。積層網膜構造が維持されます。通常の開発後、L- / M-コーンは選択的に縮退し、1か月齢からOSが徐々に短くなります。錐体光伝達タンパク質の量は同時に減少しますが、UV錐体とS錐体は10ヶ月齢でも通常のOS長を示します。インビトロ研究は、Nr2e3がCrxおよびNrlと相乗作用してロドプシン遺伝子発現を増強することを示しています。Nr2e3は錐体オプシンの発現に影響を与えません。私たちの結果は、Nr2e3の役割の知識を拡張し、人間とマウスの網膜で観察される表現型の解釈に特定の意味を持っています。さらに、私たちのモデルは、強化されたSコーン症候群（ESCS）およびその他の網膜変性疾患の治療法を見つけるための新しい機会を提供する可能性があります。"]
[98,30591527,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","ptprja","Blood","Loss-of-function mutations in PTPRJ cause a new form of inherited thrombocytopenia.",2019,"133(12):1346-1357","[Marconi C  et al.]","University of Bologna, Bologna, Italy.",30591527,"10.1182/blood-2018-07-859496 ","Inherited thrombocytopenias (ITs) are a heterogeneous group of disorders characterized by low platelet count that may result in bleeding tendency. Despite progress being made in defining the genetic causes of ITs, nearly 50% of patients with familial thrombocytopenia are affected with forms of unknown origin. Here, through exome sequencing of 2 siblings with autosomal-recessive thrombocytopenia, we identified biallelic loss-of-function variants in PTPRJ . This gene encodes for a receptor-like PTP, PTPRJ (or CD148), which is expressed abundantly in platelets and megakaryocytes. Consistent with the predicted effects of the variants, both probands have an almost complete loss of PTPRJ at the messenger RNA and protein levels. To investigate the pathogenic role of PTPRJ deficiency in hematopoiesis in vivo, we carried out CRISPR/Cas9-mediated ablation of ptprja (the ortholog of human PTPRJ) in zebrafish, which induced a significantly decreased number of CD41(+) thrombocytes in vivo. Moreover, megakaryocytes of our patients showed impaired maturation and profound defects in SDF1-driven migration and formation of proplatelets in vitro. Silencing of PTPRJ in a human megakaryocytic cell line reproduced the functional defects observed in patients'  megakaryocytes. The disorder caused by PTPRJ mutations presented as a nonsyndromic thrombocytopenia characterized by spontaneous bleeding, small-sized  platelets, and impaired platelet responses to the GPVI agonists collagen and convulxin. These platelet functional defects could be attributed to reduced activation of Src family kinases. Taken together, our data identify a new form of IT and highlight a hitherto unknown fundamental role for PTPRJ in platelet biogenesis.","fish","遺伝性血小板減少症（IT）は、出血傾向を引き起こす可能性のある血小板数の減少を特徴とする不均一なグループの障害です。ITの遺伝的原因の定義が進んでいるにもかかわらず、家族性血小板減少症の患者のほぼ50％が原因不明の形態に罹患しています。ここでは、常染色体劣性血小板減少症の2人の兄弟のエクソームシーケンシングを通じて、PTPRJの2対立遺伝子の機能喪失変異体を同定しました。この遺伝子は、血小板や巨核球で豊富に発現する受容体様PTP、PTPRJ（またはCD148）をコードしています。変異体の予測される効果と一致して、両方の発端者はメッセンジャーRNAおよびタンパク質レベルでPTPRJのほぼ完全な喪失を持っています。インビボでの造血におけるPTPRJ欠損症の病原性の役割を調査するために、ゼブラフィッシュにおいてCRISPR / Cas9を介したptprja（ヒトPTPRJのオルソログ）の切除を実施し、インビボでCD41（+）血球細胞の数を有意に減少させた。さらに、私たちの患者の巨核球は、invitroでSDF1による遊走と前血小板の形成に成熟障害と深刻な欠陥を示しました。ヒト巨核球細胞株におけるPTPRJのサイレンシングは、患者の巨核球で観察された機能的欠陥を再現しました。PTPRJ変異によって引き起こされる障害は、特発性出血、小さなサイズの血小板、およびGPVIアゴニストであるコラーゲンとコンブルキシンに対する血小板反応の障害を特徴とする非症候性血小板減少症として現れました。これらの血小板機能障害は、Srcファミリーキナーゼの活性化の低下に起因する可能性があります。まとめると、私たちのデータはITの新しい形態を特定し、血小板生合成におけるPTPRJのこれまで知られていなかった基本的な役割を浮き彫りにします。"]
[99,30953479,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","C-lectin family 14 Member A (clec14a)","BMC developmental biology","Clec14a genetically interacts with Etv2 and Vegf signaling during vasculogenesis  and angiogenesis in zebrafish.",2019,"19(1):6","[Pociute K et al.]","Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, OH, USA.",30953479,"10.1186/s12861-019-0188-6 ","BACKGROUND: C-lectin family 14 Member A (Clec14a) is a transmembrane protein specifically expressed in vascular endothelial cells during embryogenesis. Previous in vitro and in vivo studies have provided conflicting data regarding Clec14a role in promoting or inhibiting angiogenesis, therefore its functional role in vascular development remains poorly understood. RESULTS: Here we have generated a novel clec14a mutant allele in zebrafish embryos using TALEN genome editing. clec14a mutant embryos exhibit partial defects and delay in the sprouting of intersegmental vessels. These defects in angiogenesis are greatly increased upon the knockdown of a structurally related C1qr protein. Furthermore, a partial knockdown of an ETS transcription factor Etv2 results in a synergistic  effect with the clec14a mutation and inhibits expression of early vascular markers in endothelial progenitor cells, arguing that clec14a is involved in promoting vasculogenesis. In addition, Clec14a genetically interacts with Vegfa signaling. A partial knockdown of Vegfaa function in the clec14a mutant background resulted in a synergistic inhibition of intersegmental vessel sprouting. CONCLUSIONS: These results argue that clec14a is involved in both vasculogenesis and angiogenesis, and suggest that Clec14a genetically interacts with Etv2 and Vegf signaling during vascular development in zebrafish embryos.","fish","背景：C-レクチンファミリー14メンバーA（Clec14a）は、胚発生時に血管内皮細胞で特異的に発現する膜貫通タンパク質です。以前のinvitroおよびinvivo研究は、血管新生の促進または阻害におけるClec14aの役割に関して矛盾するデータを提供しており、したがって、血管発達におけるその機能的役割は十分に理解されていないままです。結果：ここでは、TALENゲノム編集を使用して、ゼブラフィッシュ胚に新しいclec14a変異対立遺伝子を生成しました。clec14a変異胚は、部分的な欠陥と分節間血管の発芽の遅延を示します。血管新生におけるこれらの欠陥は、構造的に関連するC1qrタンパク質のノックダウン時に大幅に増加します。さらに、ETS転写因子Etv2の部分的なノックダウンは、clec14a変異との相乗効果をもたらし、内皮前駆細胞における初期血管マーカーの発現を阻害し、clec14aが脈管形成の促進に関与していると主張しています。さらに、Clec14aはVegfaシグナル伝達と遺伝的に相互作用します。clec14a変異体バックグラウンドでのVegfaa機能の部分的なノックダウンは、分節間血管発芽の相乗的阻害をもたらしました。結論：これらの結果は、clec14aが脈管形成と血管新生の両方に関与していることを主張し、Clec14aがゼブラフィッシュ胚の血管発達中にEtv2およびVegfシグナル伝達と遺伝的に相互作用することを示唆しています。"]
[100,31307377,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","otulina; slc29a1a","BMC genomics","What makes a bad egg? Egg transcriptome reveals dysregulation of translational machinery and novel fertility genes important for fertilization.",2019,"20(1):584","[Cheung CT et al.]","INRA, Rennes cedex, France.",31307377,"10.1186/s12864-019-5930-8 ","BACKGROUND: Egg quality can be defined as the egg ability to be fertilized and subsequently develop into a normal embryo. Previous research has shed light on factors that can influence egg quality. Large gaps however remain including a comprehensive view of what makes a bad egg. Initial development of the embryo relies on maternally-inherited molecules, such as transcripts, deposited in the egg during its formation. Bad egg quality is therefore susceptible to be associated with alteration or dysregulation of maternally-inherited transcripts.  We performed transcriptome analysis on a large number (N = 136) of zebrafish egg  clutches, each clutch being split to monitor developmental success and perform transcriptome analysis in parallel. We aimed at drawing a molecular portrait of the egg in order to characterize the relation between egg transcriptome and developmental success and to subsequently identify new candidate genes involved in fertility. RESULTS: We identified 66 transcript that were differentially abundant in eggs of contrasted phenotype (low or high developmental success). Statistical modeling using partial least squares regression and genetics algorithm demonstrated that gene signatures from transcriptomic data can be used  to predict developmental success. The identity and function of differentially expressed genes indicate a major dysregulation of genes of the translational machinery in poor quality eggs. Two genes, otulina and slc29a1a, predominantly expressed in the ovary and dysregulated in poor quality eggs were further investigated using CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Mutants of each gene revealed remarkable subfertility whereby the majority of their eggs were unfertilizable. The Wnt pathway appeared to be dysregulated in the otulina mutant-derived eggs. CONCLUSIONS: Here we show that egg transcriptome contains molecular signatures, which can be used to predict developmental success. Our results also indicate that poor egg quality in zebrafish is associated with a dysregulation of (i) the translational machinery genes and (ii) novel fertility genes, otulina and slc29a1a, playing an important role for fertilization. Together, our observations highlight the diversity of the possible causes of egg  quality defects and reveal mechanisms of maternal origin behind the lack of fertilization and early embryonic failures that can occur under normal reproduction conditions.","fish","背景：卵の質は、受精し、その後正常な胚に成長する卵の能力として定義することができます。以前の研究は、卵の質に影響を与える可能性のある要因に光を当てています。しかし、何が悪い卵を作るのかについての包括的な見解を含めて、大きなギャップが残っています。胚の最初の発達は、その形成中に卵子に沈着した転写物などの母性遺伝分子に依存しています。したがって、悪い卵質は、母性遺伝の転写産物の変化または調節不全に関連しやすい。多数（N = 136）のゼブラフィッシュエッグクラッチでトランスクリプトーム分析を実行しました。各クラッチは、発達の成功を監視し、トランスクリプトーム分析を並行して実行するために分割されています。卵のトランスクリプトームと発育の成功との関係を特徴づけ、その後、生殖能力に関与する新しい候補遺伝子を特定するために、卵の分子像を描くことを目的としました。結果：対照的な表現型（低いまたは高い発達の成功）の卵に異なって豊富であった66の転写産物を特定しました。部分最小二乗回帰と遺伝学アルゴリズムを使用した統計モデリングは、トランスクリプトームデータからの遺伝子シグネチャーを使用して発達の成功を予測できることを示しました。差次的に発現する遺伝子の同一性と機能は、質の悪い卵における翻訳機構の遺伝子の主要な調節不全を示しています。CRISPR / Cas9を介したゲノム編集を使用して、主に卵巣で発現し、質の悪い卵で調節不全になっている2つの遺伝子、otulinaとslc29a1aをさらに調査しました。各遺伝子の変異体は、それらの卵の大部分が受精不能であるという顕著な不妊症を明らかにしました。Wnt経路は、otulina変異体由来の卵で調節不全になっているように見えました。結論：ここでは、卵トランスクリプトームに分子シグネチャーが含まれていることを示します。これは、発達の成功を予測するために使用できます。我々の結果はまた、ゼブラフィッシュの卵質の悪さは、（i）翻訳機構遺伝子と（ii）新しい受精遺伝子であるotulinaとslc29a1aの調節不全に関連しており、受精に重要な役割を果たしていることを示しています。一緒に、私たちの観察は、卵質の欠陥の考えられる原因の多様性を強調し、通常の繁殖条件下で発生する可能性のある受精の欠如と初期の胚不全の背後にある母体起源のメカニズムを明らかにします。"]
[101,31173907,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","G protein-coupled receptor 137b (gpr137ba)","Bone","A role for G protein-coupled receptor 137b in bone remodeling in mouse and zebrafish.",2019,"127:104-113","[Urso K et al.]","Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School,  Boston, MA, USA.",31173907,"10.1016/j.bone.2019.06.002 ","G protein-coupled receptor 137b (GPR137b) is an orphan seven-pass transmembrane receptor of unknown function. In mouse, Gpr137b is highly expressed in osteoclasts in vivo and is upregulated during in vitro differentiation. To elucidate the role that GPR137b plays in osteoclasts, we tested the effect of GPR137b deficiency on osteoclast maturation and resorbing activity. We used CRISPR/Cas9 gene editing in mouse-derived ER-Hoxb8 immortalized myeloid progenitors to generate GPR137b-deficient osteoclast precursors. Decreasing Gpr137b in these precursors led to increased osteoclast differentiation and bone  resorption activity. To explore the role of GPR137b during skeletal development,  we generated zebrafish deficient for the ortholog gpr137ba. Gpr137ba-deficient zebrafish are viable and fertile and do not display overt morphological defects as adults. However, analysis of osteoclast function in gpr137ba(-/-) mutants demonstrated increased bone resorption. Micro-computed tomography evaluation of vertebral bone mass and morphology demonstrated that gpr137ba-deficiency altered  the angle of the neural arch, a skeletal site with high osteoclast activity. Vital staining of gpr137ba(-/-) fish with calcein and alizarin red indicated that bone formation in the mutants is also increased, suggesting high bone turnover. These results identify GPR137b as a conserved negative regulator of osteoclast activity essential for normal resorption and patterning of the skeleton. Further, these data suggest that coordination of osteoclast and osteoblast activity is a conserved process among vertebrates and may have similar regulation.","fish","Gタンパク質結合受容体137b（GPR137b）は、機能が不明な孤立した7パス膜貫通受容体です。マウスでは、Gpr137bはin vivoで破骨細胞で高度に発現し、invitroでの分化中にアップレギュレートされます。GPR137bが破骨細胞で果たす役割を解明するために、破骨細胞の成熟と吸収活性に対するGPR137b欠損の影響をテストしました。マウス由来のER-Hoxb8不死化骨髄前駆細胞でCRISPR / Cas9遺伝子編集を使用して、GPR137b欠損破骨細胞前駆体を生成しました。これらの前駆体のGpr137bを減少させると、破骨細胞の分化と骨吸収活性が増加しました。骨格の発達中のGPR137bの役割を調査するために、オルソログgpr137baを欠損したゼブラフィッシュを生成しました。Gpr137ba欠損ゼブラフィッシュは生存可能で繁殖力があり、成虫のように明白な形態学的欠陥を示しません。ただし、gpr137ba（-/-）変異体の破骨細胞機能の分析では、骨吸収の増加が示されました。脊椎骨の質量と形態のマイクロコンピューター断層撮影評価は、gpr137ba欠損が高い破骨細胞活性を有する骨格部位である神経弓の角度を変化させることを示した。カルセインとアリザリンレッドによるgpr137ba（-/-）魚のバイタル染色は、変異体の骨形成も増加していることを示しており、高い骨代謝回転を示唆しています。これらの結果は、GPR137bが、骨格の正常な吸収とパターン形成に不可欠な破骨細胞活性の保存された負の調節因子であることを示しています。さらに、これらのデータは、破骨細胞と骨芽細胞の活動の調整が脊椎動物間で保存されたプロセスであり、同様の調節をしている可能性があることを示唆しています。"]
[102,30715179,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","microtubule associated protein 11","Brain","Mutations in the microtubule-associated protein MAP11 (C7orf43) cause microcephaly in humans and zebrafish.",2019,"142(3):574-585","[Perez Y et al.]","Ben-Gurion University  of the Negev, Beer Sheva, Israel.",30715179,"10.1093/brain/awz004 ","Microtubule associated protein 11 (MAP11, previously termed C7orf43) encodes a highly conserved protein whose function is unknown. Through genome-wide linkage analysis combined with whole exome sequencing, we demonstrate that human autosomal recessive primary microcephaly is caused by a truncating mutation in MAP11. Moreover, homozygous MAP11-orthologue CRISPR/Cas9 knock-out zebrafish presented with microcephaly and decreased neuronal proliferation, recapitulating  the human phenotype. We demonstrate that MAP11 is ubiquitously transcribed with high levels in brain and cerebellum. Immunofluorescence and co-immunoprecipitation studies in SH-SY5Y cells showed that MAP11 associates with mitotic spindles, co-localizing and physically associating with alpha-tubulin during mitosis. MAP11 expression precedes alpha-tubulin in gap formation of cell  abscission at the midbody and is co-localized with PLK1, a key regulator of cytokinesis, at the edges of microtubule extensions of daughter cells post cytokinesis abscission, implicating a role in mitotic spindle dynamics and in regulation of cell abscission during cytokinesis. Finally, lentiviral-mediated silencing of MAP11 diminished SH-SY5Y cell viability, reducing proliferation rather than affecting apoptosis. Thus, MAP11 encodes a microtubule-associated protein that plays a role in spindle dynamics and cell division, in which mutations cause microcephaly in humans and zebrafish.","fish","微小管関連タンパク質11（MAP11、以前はC7orf43と呼ばれていました）は、機能が不明な高度に保存されたタンパク質をコードしています。全エクソームシーケンシングと組み合わせたゲノムワイドリンケージ分析を通じて、ヒト常染色体劣性原発性小頭蓋症がMAP11のトランケート変異によって引き起こされることを示しています。さらに、ホモ接合型MAP11-オルソログCRISPR / Cas9ノックアウトゼブラフィッシュは、小頭症を呈し、神経増殖を減少させ、ヒトの表現型を再現しました。MAP11が脳と小脳で高レベルで遍在的に転写されることを示します。SH-SY5Y細胞における免疫蛍光および免疫共沈降の研究は、MAP11が有糸分裂紡錘体と結合し、有糸分裂中にα-チューブリンと共局在および物理的に結合することを示しました。MAP11の発現は、中央体での細胞離層のギャップ形成においてα-チューブリンに先行し、細胞質分裂後の娘細胞の微小管伸長の端で、細胞質分裂の重要な調節因子であるPLK1と共局在し、有糸分裂紡錘体動態における役割を示唆しています。細胞質分裂中の細胞離層の調節において。最後に、MAP11のレンチウイルスを介したサイレンシングはSH-SY5Y細胞の生存率を低下させ、アポトーシスに影響を与えるのではなく増殖を減少させました。したがって、MAP11は、紡錘体のダイナミクスと細胞分裂に関与する微小管関連タンパク質をコードしており、突然変異によってヒトとゼブラフィッシュに小頭症が引き起こされます。"]
[103,30668673,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","plphp","Brain","PLPHP deficiency: clinical, genetic, biochemical, and mechanistic insights.",2019,"142(3):542-559","[Johnstone DL et al.]","Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, Ottawa, ON, Canada.",30668673,"10.1093/brain/awy346 ","Biallelic pathogenic variants in PLPBP (formerly called PROSC) have recently been shown to cause a novel form of vitamin B6-dependent epilepsy, the pathophysiological basis of which is poorly understood. When left untreated, the  disease can progress to status epilepticus and death in infancy. Here we present  12 previously undescribed patients and six novel pathogenic variants in PLPBP. Suspected clinical diagnoses prior to identification of PLPBP variants included mitochondrial encephalopathy (two patients), folinic acid-responsive epilepsy (one patient) and a movement disorder compatible with AADC deficiency (one patient). The encoded protein, PLPHP is believed to be crucial for B6 homeostasis. We modelled the pathogenicity of the variants and developed a clinical severity scoring system. The most severe phenotypes were associated with variants leading to loss of function of PLPBP or significantly affecting protein  stability/PLP-binding. To explore the pathophysiology of this disease further, we developed the first zebrafish model of PLPHP deficiency using CRISPR/Cas9. Our model recapitulates the disease, with plpbp-/- larvae showing behavioural, biochemical, and electrophysiological signs of seizure activity by 10 days post-fertilization and early death by 16 days post-fertilization. Treatment with  pyridoxine significantly improved the epileptic phenotype and extended lifespan in plpbp-/- animals. Larvae had disruptions in amino acid metabolism as well as GABA and catecholamine biosynthesis, indicating impairment of PLP-dependent enzymatic activities. Using mass spectrometry, we observed significant B6 vitamer level changes in plpbp-/- zebrafish, patient fibroblasts and PLPHP-deficient HEK293 cells. Additional studies in human cells and yeast provide the first empirical evidence that PLPHP is localized in mitochondria and may play a role in mitochondrial metabolism. These models provide new insights into disease mechanisms and can serve as a platform for drug discovery.","fish","PLPBP（以前はPROSCと呼ばれていた）の二対立遺伝子の病原性多様体は、最近、新しい形態のビタミンB6依存性てんかんを引き起こすことが示されましたが、その病態生理学的根拠はよくわかっていません。治療せずに放置すると、病気はてんかん重積状態に進行し、乳児期に死亡する可能性があります。ここでは、これまでに説明されていない12人の患者とPLPBPの6つの新規病原性多様体を紹介します。PLPBP変異体を同定する前の疑わしい臨床診断には、ミトコンドリア脳症（2人の患者）、葉酸反応性てんかん（1人の患者）、およびAADC欠損症と互換性のある運動障害（1人の患者）が含まれていました。コード化されたタンパク質であるPLPHPは、B6ホメオスタシスに不可欠であると考えられています。変異体の病原性をモデル化し、臨床的重症度スコアリングシステムを開発しました。最も深刻な表現型は、PLPBPの機能の喪失につながる、またはタンパク質の安定性/ PLP結合に大きな影響を与える変異体と関連していた。この病気の病態生理学をさらに調査するために、CRISPR / Cas9を使用してPLPHP欠損症の最初のゼブラフィッシュモデルを開発しました。私たちのモデルは病気を再現し、plpbp-/-幼虫は受精後10日までに発作活動の行動的、生化学的、電気生理学的兆候を示し、受精後16日までに早期死亡を示します。ピリドキシンによる治療は、plpbp-/-動物のてんかん表現型を有意に改善し、寿命を延ばしました。幼虫は、アミノ酸代謝、GABAおよびカテコラミン生合成に混乱があり、PLP依存性酵素活性の障害を示しています。質量分析を使用して、plpbp-/-ゼブラフィッシュ、患者の線維芽細胞、およびPLPHP欠損HEK293細胞で有意なB6ビタミンレベルの変化を観察しました。ヒト細胞と酵母での追加の研究は、PLPHPがミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアの代謝に役割を果たす可能性があるという最初の経験的証拠を提供します。これらのモデルは、疾患メカニズムへの新しい洞察を提供し、創薬のためのプラットフォームとして機能することができます。"]
[104,31566834,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","fzd4","Developmental dynamics","Frizzled 4 regulates ventral blood vessel remodeling in the zebrafish retina.",2019,"248(12):1243-1256","[Caceres L et al.]","IWK Health Centre/Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada.",31566834,"10.1002/dvdy.117 ","BACKGROUND: Familial exudative vitreoretinopathy (FEVR) is a rare congenital disorder characterized by a lack of blood vessel growth to the periphery of the retina with secondary fibrovascular proliferation at the vascular-avascular junction. These structurally abnormal vessels cause leakage and hemorrhage, while the fibroproliferative scarring results in retinal dragging, detachment and blindness. Mutations in the FZD4 gene represent one of the most common causes of  FEVR. METHODS: A loss of function mutation resulting from a 10-nucleotide insertion into exon 1 of the zebrafish fzd4 gene was generated using transcription activator-like effector nucleases (TALENs). Structural and functional integrity of the retinal vasculature was examined by fluorescent microscopy and optokinetic responses. RESULTS: Zebrafish retinal vasculature is asymmetrically distributed along the dorsoventral axis, with active vascular remodeling on the ventral surface of the retina throughout development. fzd4 mutants exhibit disorganized ventral retinal vasculature with discernable tubular fusion by week 8 of development. Furthermore, fzd4 mutants have impaired optokinetic responses requiring increased illumination. CONCLUSION: We have generated a visually impaired zebrafish FEVR model exhibiting abnormal retinal vasculature. These fish provide a tractable system for studying vascular biology  in retinovascular disorders, and demonstrate the feasibility of using zebrafish for evaluating future FEVR genes identified in humans.","fish","背景：家族性滲出性硝子体網膜症（FEVR）は、網膜の周辺への血管成長の欠如と、血管-無血管接合部での二次線維血管増殖を特徴とするまれな先天性障害です。これらの構造的に異常な血管は漏出と出血を引き起こし、線維増殖性瘢痕は網膜の引きずり、剥離、失明を引き起こします。FZD4遺伝子の変異は、FEVRの最も一般的な原因の1つです。方法：ゼブラフィッシュfzd4遺伝子のエキソン1への10ヌクレオチド挿入に起因する機能喪失変異は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を使用して生成されました。網膜血管系の構造的および機能的完全性を、蛍光顕微鏡法および視運動学的応答によって調べた。結果：ゼブラフィッシュの網膜血管系は背腹軸に沿って非対称に分布しており、発達中は網膜の腹側表面で活発な血管リモデリングが見られます。fzd4変異体は、発達の8週目までに、識別可能な尿細管融合を伴う無秩序な腹側網膜血管系を示します。さらに、fzd4変異体は、照明の増加を必要とする視運動反応が損なわれています。結論：異常な網膜血管系を示す視覚障害のあるゼブラフィッシュFEVRモデルを生成しました。これらの魚は、網膜血管障害における血管生物学を研究するための扱いやすいシステムを提供し、ヒトで同定された将来のFEVR遺伝子を評価するためにゼブラフィッシュを使用することの実現可能性を示しています。"]
[105,30615274,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","miR-18a","Developmental neurobiology","The MicroRNA, miR-18a, Regulates NeuroD and Photoreceptor Differentiation in the  Retina of Zebrafish.",2019,"79(2):202-219","[Taylor SM  et al.]","University of West Florida, Pensacola, FL, USA.",30615274,"10.1002/dneu.22666 ","During embryonic retinal development, six types of retinal neurons are generated  from multipotent progenitors in a strict spatiotemporal pattern. This pattern requires cell cycle exit (i.e. neurogenesis) and differentiation to be precisely  regulated in a lineage-specific manner. In zebrafish, the bHLH transcription factor NeuroD governs photoreceptor genesis through Notch signaling but also governs photoreceptor differentiation though distinct mechanisms that are currently unknown. Also unknown are the mechanisms that regulate NeuroD and the spatiotemporal pattern of photoreceptor development. Members of the miR-17-92 microRNA cluster regulate CNS neurogenesis, and a member of this cluster, miR-18a, is predicted to target neuroD mRNA. The purpose of this study was to determine if, in the developing zebrafish retina, miR-18a regulates NeuroD and if it plays a role in photoreceptor development. Quantitative RT-PCR showed that, of the three miR-18 family members (miR-18a, b, and c), miR-18a expression most closely parallels neuroD expression. Morpholino oligonucleotides and CRISPR/Cas9  gene editing were used for miR-18a loss-of-function (LOF) and both resulted in larvae with more mature photoreceptors at 70 hpf without affecting cell proliferation. Western blot showed that miR-18a LOF increases NeuroD protein levels and in vitro dual luciferase assay showed that miR-18a directly interacts  with the 3' UTR of neuroD. Finally, tgif1 mutants have increased miR-18a expression, less NeuroD protein and fewer mature photoreceptors, and the photoreceptor deficiency is rescued by miR-18a knockdown. Together, these results show that, independent of neurogenesis, miR-18a regulates the timing of photoreceptor differentiation and indicate that this occurs through post-transcriptional regulation of NeuroD.","fish","胚の網膜の発達中に、6種類の網膜ニューロンが厳密な時空間パターンで多能性前駆細胞から生成されます。このパターンでは、細胞周期の終了（すなわち神経新生）と分化を系統特異的な方法で正確に調節する必要があります。ゼブラフィッシュでは、bHLH転写因子NeuroDは、Notchシグナル伝達を介して光受容体の発生を支配しますが、現在は不明な別個のメカニズムを介して光受容体の分化も支配します。NeuroDと光受容体発達の時空間パターンを調節するメカニズムも不明です。miR-17-92 microRNAクラスターのメンバーはCNS神経新生を調節し、このクラスターのメンバーであるmiR-18aはneuroDmRNAを標的とすることが予測されています。この研究の目的は、発生中のゼブラフィッシュ網膜において、miR-18aがNeuroDを調節するかどうか、およびそれが光受容体の発生に役割を果たすかどうかを判断することでした。定量的RT-PCRは、3つのmiR-18ファミリーメンバー（miR-18a、b、およびc）のうち、miR-18aの発現がneuroDの発現と最も密接に類似していることを示しました。モルフォリノオリゴヌクレオチドとCRISPR / Cas9遺伝子編集がmiR-18a機能喪失（LOF）に使用され、どちらも細胞増殖に影響を与えることなく、70hpfでより成熟した光受容体を持つ幼虫をもたらしました。ウエスタンブロットは、miR-18a LOFがNeuroDタンパク質レベルを増加させることを示し、in vitroデュアルルシフェラーゼアッセイは、miR-18aがneuroDの3'UTRと直接相互作用することを示しました。最後に、tgif1変異体は、miR-18aの発現を増加させ、NeuroDタンパク質を減らし、成熟した光受容体を減らし、光受容体の欠損はmiR-18aノックダウンによって救済されます。まとめると、これらの結果は、神経新生とは無関係に、miR-18aが光受容体分化のタイミングを調節することを示し、これがNeuroDの転写後調節を通じて起こることを示しています。"]
[106,30765415,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","il34; csf1","Disease models & mechanisms","Reverse genetic screen reveals that Il34 facilitates yolk sac macrophage distribution and seeding of the brain.",2019,"12(3)","[Kuil LE et al.]","Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands.",30765415,"10.1242/dmm.037762 ","Microglia are brain-resident macrophages, which have specialized functions important in brain development and in disease. They colonize the brain in early embryonic stages, but few factors that drive the migration of yolk sac macrophages (YSMs) into the embryonic brain, or regulate their acquisition of specialized properties, are currently known. Here, we present a CRISPR/Cas9-based in vivo reverse genetic screening pipeline to identify new microglia regulators using zebrafish. Zebrafish larvae are particularly suitable due to their external development, transparency and conserved microglia features. We targeted putative  microglia regulators, by Cas9/gRNA complex injections, followed by Neutral-Red-based visualization of microglia. Microglia were quantified automatically in 3-day-old larvae using a software tool we called SpotNGlia. We identified that loss of zebrafish colony-stimulating factor 1 receptor (Csf1r) ligand, Il34, caused reduced microglia numbers. Previous studies on the role of IL34 in microglia development in vivo were ambiguous. Our data, and a concurrent  paper, show that, in zebrafish, il34 is required during the earliest seeding of the brain by microglia. Our data also indicate that Il34 is required for YSM distribution to other organs. Disruption of the other Csf1r ligand, Csf1, did not reduce microglia numbers in mutants, whereas overexpression increased the number  of microglia. This shows that Csf1 can influence microglia numbers, but might not be essential for the early seeding of the brain. In all, we identified il34 as a  modifier of microglia colonization, by affecting distribution of YSMs to target organs, validating our reverse genetic screening pipeline in zebrafish.This article has an associated First Person interview with the joint first authors of  the paper.","fish","ミクログリアは脳に存在するマクロファージであり、脳の発達と病気に重要な特殊な機能を持っています。それらは初期の胚の段階で脳にコロニーを形成しますが、卵黄嚢マクロファージ（YSM）の胚の脳への移動を促進する、または特殊な特性の獲得を調節するいくつかの要因が現在知られています。ここでは、ゼブラフィッシュを使用して新しいミクログリアレギュレーターを識別するためにCRISPR / Cas9ベースのinvivo逆遺伝子スクリーニングパイプラインを提示します。ゼブラフィッシュの幼虫は、その外部の発達、透明性、および保存されたミクログリアの特徴のために特に適しています。我々は、Cas9 / gRNA複合体注射、続いてミクログリアのニュートラルレッドベースの視覚化によって、推定ミクログリアレギュレーターを標的としました。ミクログリアは、SpotNGliaと呼ばれるソフトウェアツールを使用して、生後3日目の幼虫で自動的に定量化されました。ゼブラフィッシュコロニー刺激因子1受容体（Csf1r）リガンド、Il34の喪失がミクログリア数の減少を引き起こしたことを確認しました。インビボでのミクログリアの発達におけるIL34の役割に関する以前の研究はあいまいでした。私たちのデータと同時論文は、ゼブラフィッシュでは、ミクログリアによる脳の最も早い播種中にil34が必要であることを示しています。私たちのデータは、他の臓器へのYSMの配布にはIl34が必要であることも示しています。他のCsf1rリガンドであるCsf1の破壊は、変異体のミクログリア数を減少させませんでしたが、過剰発現はミクログリアの数を増加させました。これは、Csf1がミクログリアの数に影響を与える可能性があることを示していますが、脳の早期播種には必須ではない可能性があります。全体として、ゼブラフィッシュでの逆遺伝子スクリーニングパイプラインを検証し、標的臓器へのYSMの分布に影響を与えることにより、ミクログリアコロニー形成の修飾因子としてil34を特定しました。この記事には、論文の共同筆頭著者との関連するファーストパーソンインタビューがあります。"]
[107,31466915,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","MiR-125a","EBioMedicine","Dysregulated miR-125a promotes angiogenesis through enhanced glycolysis.",2019,"47:402-413","[Wade SM et al.]","Trinity College Dublin, Dublin, Ireland.",31466915,"10.1016/j.ebiom.2019.08.043 ","BACKGROUND: Although neoangiogenesis is a hallmark of chronic inflammatory diseases such as inflammatory arthritis and many cancers, therapeutic agents targeting the vasculature remain elusive. Here we identified miR-125a as an important regulator of angiogenesis. METHODS: MiRNA levels were quantified in Psoriatic Arthritis (PsA) synovial-tissue by RT-PCR and compared to macroscopic synovial vascularity. HMVEC were transfected with anti-miR-125a and angiogenic mechanisms quantified using tube formation assays, transwell invasion chambers, wound repair, RT-PCR and western blot. Real-time analysis of EC metabolism was assessed using the XF-24 Extracellular-Flux Analyzer. Synovial expression of metabolic markers was assessed by immunohistochemistry and immunofluorescent staining. MiR-125a CRISPR/Cas9-based knock-out zebrafish were generated and vascular development assessed. Finally, glycolytic blockade using 3PO, which inhibits Phosphofructokinase-fructose-2,6-bisphophatase 3 (PFKFB3), was assessed  in miR-125a-/- ECs and zebrafish embryos. FINDINGS: MiR-125a is significantly decreased in PsA synovium and inversely associated with macroscopic vascularity.  In-vivo, CRISPR/cas9 miR-125a(-/-) zebrafish displayed a hyper-branching phenotype. In-vitro, miR-125a inhibition promoted EC tube formation, branching, migration and invasion, effects paralleled by a shift in their metabolic profile  towards glycolysis. This metabolic shift was also observed in the PsA synovial vasculature where increased expression of glucose transporter 1 (GLUT1), PFKFB3 and Pyruvate kinase muscle isozyme M2 (PKM2) were demonstrated. Finally, blockade of PFKFB3 significantly inhibited anti-miR-125a-induced angiogenic mechanisms in-vitro, paralleled by normalisation of vascular development of CRISPR/cas9 miR-125a(-/-) zebrafish embryos. INTEPRETATION: Our results provide evidence that miR-125a deficiency enhances angiogenic processes through metabolic reprogramming of endothelial cells. FUND: Irish Research Council, Arthritis Ireland, EU Seventh Framework Programme (612218/3D-NET).","fish","背景：血管新生は炎症性関節炎や多くの癌などの慢性炎症性疾患の特徴ですが、血管系を標的とする治療薬はとらえどころのないままです。ここでは、miR-125aを血管新生の重要な調節因子として特定しました。方法：miRNAレベルは、RT-PCRによって乾癬性関節炎（PsA）滑膜組織で定量化され、肉眼で見える滑膜血管分布と比較されました。HMVECに抗miR-125aをトランスフェクトし、血管新生メカニズムをチューブ形成アッセイ、トランスウェル浸潤チャンバー、創傷修復、RT-PCR、ウエスタンブロットを使用して定量化しました。EC代謝のリアルタイム分析は、XF-24細胞外フラックスアナライザーを使用して評価されました。代謝マーカーの滑膜発現は、免疫組織化学および免疫蛍光染色によって評価された。MiR-125a CRISPR / Cas9ベースのノックアウトゼブラフィッシュが生成され、血管の発達が評価されました。最後に、ホスホフルクトキナーゼ-フルクトース-2,6-ビスホスファターゼ3（PFKFB3）を阻害する3POを使用した解糖系遮断を、miR-125a-/-ECおよびゼブラフィッシュ胚で評価しました。所見：MiR-125aはPsA滑膜で有意に減少し、肉眼で見える血管分布と逆に関連しています。インビボでは、CRISPR / cas9 miR-125a（-/-）ゼブラフィッシュは超分岐表現型を示しました。インビトロでは、miR-125a阻害は、EC管の形成、分岐、移動、および浸潤を促進し、その効果は、解糖への代謝プロファイルのシフトと並行して行われました。この代謝シフトは、グルコーストランスポーター1（GLUT1）、PFKFB3、およびピルビン酸キナーゼ筋アイソザイムM2（PKM2）の発現の増加が示されたPsA滑膜血管系でも観察されました。最後に、PFKFB3の遮断は、CRISPR / cas9 miR-125a（-/-）ゼブラフィッシュ胚の血管発達の正常化と並行して、invitroで抗miR-125a誘発性の血管新生メカニズムを有意に阻害しました。統合：私たちの結果は、miR-125aの欠損が内皮細胞の代謝再プログラミングを通じて血管新生プロセスを強化するという証拠を提供します。基金：アイルランド研究評議会、アイルランド関節炎、EU第7フレームワークプログラム（612218 / 3D-NET）。"]
[108,31262711,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","Tumour necrosis factor receptor associated factor 6 (TRAF6)","EBioMedicine","TRAF6 function as a novel co-regulator of Wnt3a target genes in prostate cancer.",2019,"45:192-207","[Aripaka K et al.]","Umea University, Umea, Sweden.",31262711,"10.1016/j.ebiom.2019.06.046 ","BACKGROUND: Tumour necrosis factor receptor associated factor 6 (TRAF6) promotes  inflammation in response to various cytokines. Aberrant Wnt3a signals promotes cancer progression through accumulation of beta-Catenin. Here we investigated a potential role for TRAF6 in Wnt signaling. METHODS: TRAF6 expression was silenced by siRNA in human prostate cancer (PC3U) and human colorectal SW480 cells and by  CRISPR/Cas9 in zebrafish. Several biochemical methods and analyses of mutant phenotype in zebrafish were used to analyse the function of TRAF6 in Wnt signaling. FINDINGS: Wnt3a-treatment promoted binding of TRAF6 to the Wnt co-receptors LRP5/LRP6 in PC3U and LNCaP cells in vitro. TRAF6 positively regulated mRNA expression of beta-Catenin and subsequent activation of Wnt target genes in PC3U cells. Wnt3a-induced invasion of PC3U and SW480 cells were significantly reduced when TRAF6 was silenced by siRNA. Database analysis revealed a correlation between TRAF6 mRNA and Wnt target genes in patients with prostate cancer, and high expression of LRP5, TRAF6 and c-Myc correlated with poor prognosis. By using CRISPR/Cas9 to silence TRAF6 in zebrafish, we confirm TRAF6 as a key molecule in Wnt3a signaling for expression of Wnt target genes. INTERPRETATION: We identify TRAF6 as an important component in Wnt3a signaling to promote activation of Wnt target genes, a finding important for understanding mechanisms driving prostate cancer progression. FUND: KAW 2012.0090, CAN 2017/544, Swedish Medical Research Council (2016-02513), Prostatacancerforbundet, Konung Gustaf V:s Frimurarestiftelse and Cancerforskningsfonden Norrland. The funders did not play a role in manuscript design, data collection, data analysis, interpretation nor writing of the manuscript.","fish","背景：腫瘍壊死因子受容体関連因子6（TRAF6）は、さまざまなサイトカインに反応して炎症を促進します。異常なWnt3aシグナルは、ベータカテニンの蓄積を通じて癌の進行を促進します。ここでは、Wntシグナル伝達におけるTRAF6の潜在的な役割を調査しました。方法：TRAF6の発現は、ヒト前立腺癌（PC3U）およびヒト結腸直腸SW480細胞ではsiRNAによって、ゼブラフィッシュではCRISPR / Cas9によってサイレンシングされました。ゼブラフィッシュの変異表現型のいくつかの生化学的方法と分析を使用して、Wntシグナル伝達におけるTRAF6の機能を分析しました。所見：Wnt3a処理は、invitroでPC3UおよびLNCaP細胞のWnt補助受容体LRP5 / LRP6へのTRAF6の結合を促進しました。TRAF6は、ベータカテニンのmRNA発現と、それに続くPC3U細胞のWnt標的遺伝子の活性化を正に調節しました。TRAF6がsiRNAによってサイレンシングされた場合、Wnt3aによって誘導されるPC3UおよびSW480細胞の浸潤は大幅に減少しました。データベース分析により、前立腺癌患者におけるTRAF6 mRNAとWnt標的遺伝子との相関関係が明らかになり、LRP5、TRAF6、およびc-Mycの高発現は予後不良と相関関係がありました。CRISPR / Cas9を使用してゼブラフィッシュのTRAF6をサイレンシングすることにより、TRAF6がWnt標的遺伝子の発現のWnt3aシグナル伝達における重要な分子であることを確認します。解釈：TRAF6は、Wntターゲット遺伝子の活性化を促進するWnt3aシグナル伝達の重要な要素であり、前立腺癌の進行を促進するメカニズムを理解するために重要な発見です。基金：KAW 2012.0090、CAN 2017/544、Swedish Medical Research Council（2016-02513）、Prostatacancerforbundet、Konung Gustaf V：s Frimurarestiftelse、Cancerforskningsfonden Norrland 資金提供者は、原稿のデザイン、データ収集、データ分析、解釈、または原稿の執筆において役割を果たしませんでした。"]
[109,30668682,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","gh1","Endocrinology","Loss of Growth Hormone Gene (gh1) in Zebrafish Arrests Folliculogenesis in Females and Delays Spermatogenesis in Males.",2019,"160(3):568-586","[Hu Z et al.]","University of Macau, Macau, China.",30668682,"10.1210/en.2018-00878 ","As a master hormone controlling growth and metabolism, GH is also known to regulate reproduction. Studies in mammals have shown that mutations in GH or its  receptor (GHR) not only result in retardation in body growth but also reproductive dysfunctions in both sexes. However, the roles of GH in reproduction of other vertebrates are poorly defined. In this study, we created two zebrafish  GH (gh1) mutant lines using CRISPR/Cas9. The mutant developed normally up to 14 days postfertilization (dpf); however, a high rate of mortality was observed afterward in both lines, and only a small number of mutant fish could survive to  adult stage. The body growth of the mutants was significantly retarded in both sexes in a gene dose-dependent manner compared with their wild-type siblings. A severe dysfunction of gonadal development was observed in survived mutant females, with ovarian folliculogenesis being arrested completely at primary growth stage until 100 dpf. Interestingly, the folliculogenesis in the mutant resumed after months of delay with a certain number of follicles entering vitellogenic growth. As for male reproduction, although the spermatogenesis in mutant males seemed normal in adults, the GH-insufficient heterozygote showed an  obvious delay of spermatogenesis (puberty onset) at early developmental stages. The adult mutant males could not breed with wild-type females through natural spawning; however, the sperm isolated from the mutant testes could fertilize eggs through artificial fertilization. This study provides further genetic evidence for the dependence of puberty onset on somatic growth, but not age, in fish.","fish","成長と代謝を制御するマスターホルモンとして、GHは生殖を調節することも知られています。哺乳類の研究では、GHまたはその受容体（GHR）の変異は、体の成長を遅らせるだけでなく、男女の生殖機能障害を引き起こすことが示されています。ただし、他の脊椎動物の繁殖におけるGHの役割は十分に定義されていません。この研究では、CRISPR / Cas9を使用して2つのゼブラフィッシュGH（gh1）変異株を作成しました。変異体は通常、受精後14日（dpf）まで発生しました。しかし、その後、両方の系統で高い死亡率が観察され、成体期まで生き残ることができた変異魚はごく少数でした。突然変異体の体の成長は、野生型の兄弟と比較して、遺伝子の用量依存的に両性で有意に遅延した。性腺発達の重度の機能不全が生存した突然変異雌で観察され、卵巣卵胞形成は100dpfまで一次成長段階で完全に停止した。興味深いことに、変異体の卵胞形成は数ヶ月の遅延の後に再開し、特定の数の卵胞が卵胞形成の成長に入りました。男性の生殖に関しては、突然変異した男性の精子形成は成人では正常に見えたが、GHが不十分なヘテロ接合体は発達の初期段階で精子形成の明らかな遅延（思春期の開始）を示した。成体の突然変異体のオスは、自然の産卵によって野生型のメスと繁殖することができませんでした。しかし、変異精巣から分離された精子は、人工授精によって卵子を受精させることができます。この研究は、思春期の発症が魚の体の成長に依存しているが、年齢には依存していないことのさらなる遺伝的証拠を提供します。"]
[110,31600704,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","pxr; nrf2","Environmental pollution","Pxr- and Nrf2- mediated induction of ABC transporters by heavy metal ions in zebrafish embryos.",2019,"255(Pt 2):113329","[Hu J et al.]","Soochow University,  Suzhou, Jiangsu, China.",31600704,"10.1016/j.envpol.2019.113329 ","Transcription factors including pregnane X receptor (Pxr) and nuclear factor-erythroid 2-related factor-2 (Nrf2) are important modulators of Adenosine  triphosphate-binding cassette (ABC) transporters in mammalian cells. However, whether such modulation is conserved in zebrafish embryos remains largely unknown. In this manuscript, pxr- and nrf2-deficient models were constructed with CRISPR/Cas9 system, to evaluate the individual function of Pxr and Nrf2 in the regulation of ABC transporters and detoxification of heavy metal ions like Cd(2+) and Ag(+). As a result, both Cd(2+) and Ag(+) conferred extensive interactions with ABC transporters in wild type (WT) embryos: their accumulation and toxicity  were affected by the activity of ABC transporters, and they significantly induced the mRNA expressions of ABC transporters. These induction effects were reduced by the mutation of pxr and nrf2, but elevations in the basal expression of ABC transporters compensated for the loss of their inducibility. This could be an explanation for remaining transporter function in both mutant models as well as the unaltered toxicity of metal ions in pxr-deficient embryos. However, mutation  of nrf2 disrupted the production of glutathione (GSH), resulting in the enhanced  toxicity of Cd(2+)/Ag(+) in zebrafish embryos. In addition, elevated expressions  of other transcription factors like aryl hydrocarbon receptor (ahr) 1b, peroxisome proliferator-activated receptor (ppar)-beta, and nrf2 were found in pxr-deficient models without any treatment, while enhanced induction of ahr1b, ppar-beta and pxr could only be seen in nrf2-deficient embryos after the treatment of metal ions, indicating different compensation phenomena for the absence of transcription factors. After all, pxr-deficient and nrf2-deficient zebrafish embryos are useful tools in the functional investigation of Pxr and Nrf2 in the early life stages of aquatic organisms. However, the compensatory mechanisms should be taken into consideration when interpreting the results and need in-depth investigations.","fish","プレグナンX受容体（Pxr）および核因子-赤血球2関連因子-2（Nrf2）を含む転写因子は、哺乳類細胞におけるアデノシン三リン酸結合カセット（ABC）トランスポーターの重要なモジュレーターです。ただし、そのような変調がゼブラフィッシュの胚で保存されているかどうかはほとんど不明のままです。この原稿では、pxrおよびnrf2欠損モデルがCRISPR / Cas9システムで構築され、ABCトランスポーターの調節およびCd（2+）やAg（+）などの重金属イオンの無害化におけるPxrおよびNrf2の個々の機能を評価しました。 ）。その結果、Cd（2+）とAg（+）の両方が、野生型（WT）胚のABCトランスポーターとの広範な相互作用をもたらしました。それらの蓄積と毒性は、ABCトランスポーターの活性によって影響を受け、 ABCトランスポーター。これらの誘導効果は、pxrとnrf2の変異によって減少しましたが、ABCトランスポーターの基礎発現の上昇は、それらの誘導性の喪失を補いました。これは、両方の変異体モデルでトランスポーター機能が残っていること、およびpxr欠損胚における金属イオンの毒性が変化していないことの説明となる可能性があります。ただし、nrf2の変異により、グルタチオン（GSH）の生成が中断され、ゼブラフィッシュ胚におけるCd（2 +）/ Ag（+）の毒性が増強されました。さらに、アリール炭化水素受容体（ahr）1b、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ppar）-ベータ、nrf2などの他の転写因子の発現上昇が、治療なしのpxr欠損モデルで見られ、ahr1b、ppar-の誘導が増強されました。ベータおよびpxrは、金属イオンの処理後のnrf2欠損胚でのみ見られ、転写因子の不在に対する異なる補償現象を示しています。結局のところ、pxr欠損およびnrf2欠損ゼブラフィッシュ胚は、水生生物の初期のライフステージにおけるPxrおよびNrf2の機能調査において有用なツールです。ただし、結果を解釈する際には補償メカニズムを考慮に入れる必要があり、詳細な調査が必要です。"]
[111,31100023,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","scleraxis homolog a; scleraxis homolog b","FASEB journal","Scleraxis genes are required for normal musculoskeletal development and for rib growth and mineralization in zebrafish.",2019,"33(8):9116-9130","[Kague E et al.]","University of Bristol, Bristol, UK.",31100023,"10.1096/fj.201802654RR ","Tendons are an essential part of the musculoskeletal system, connecting muscle and skeletal elements to enable force generation. The transcription factor scleraxis marks vertebrate tendons from early specification. Scleraxis-null mice  are viable and have a range of tendon and bone defects in the trunk and limbs but no described cranial phenotype. We report the expression of zebrafish scleraxis orthologs: scleraxis homolog (scx)-a and scxb in cranial and intramuscular tendons and in other skeletal elements. Single mutants for either scxa or scxb, generated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are viable and fertile as adult fish. Although scxb mutants show no obvious phenotype, scxa mutant embryos have defects in cranial tendon maturation and muscle misalignment. Mutation of both scleraxis genes results in more severe defects in cranial tendon differentiation, muscle and cartilage dysmorphogenesis and paralysis, and lethality by 2-5 wk, which indicates an essential function of scleraxis for craniofacial development.  At juvenile and adult stages, ribs in scxa mutants fail to mineralize and/or are  small and heavily fractured. Scxa mutants also have smaller muscle volume, abnormal swim movement, and defects in bone growth and composition. Scleraxis function is therefore essential for normal craniofacial form and function and vital for fish development.-Kague, E., Hughes, S. M., Lawrence, E. A., Cross, S., Martin-Silverstone, E., Hammond, C. L., Hinits, Y. Scleraxis genes are required for normal musculoskeletal development and for rib growth and mineralization in zebrafish.","fish","腱は筋骨格系の重要な部分であり、力の生成を可能にするために筋肉と骨格の要素を接続します。転写因子硬化は、初期の仕様から脊椎動物の腱をマークします。Scleraxis-nullマウスは生存可能であり、体幹と四肢にさまざまな腱と骨の欠陥がありますが、頭蓋の表現型は説明されていません。ゼブラフィッシュの硬化オルソログの発現を報告します：頭蓋および筋肉内の腱および他の骨格要素における硬化ホモログ（scx）-aおよびscxb。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）によって生成された、scxaまたはscxbの単一変異体は、成魚として生存可能で肥沃です。scxb変異体は明らかな表現型を示していませんが、scxa変異体の胚には、頭蓋腱の成熟と筋肉の不整合に欠陥があります。両方の硬化遺伝子の変異は、頭蓋腱分化、筋肉および軟骨の異形形成および麻痺、ならびに頭蓋顔面発達のための硬化の本質的な機能を示す2〜5週間の致死性においてより深刻な欠陥をもたらす。若年期および成人期では、scxa変異体の肋骨は石灰化に失敗し、および/または小さく、ひどく骨折します。Scxa変異体はまた、筋肉量が少なく、泳ぎの動きが異常で、骨の成長と組成に欠陥があります。したがって、硬化機能は正常な頭蓋顔面の形態と機能に不可欠であり、魚の発育に不可欠です-Kague、E.、Hughes、SM、Lawrence、EA、Cross、S.、Martin-Silverstone、E.、Hammond、CL、Hinits、Y 。硬化遺伝子は、正常な筋骨格の発達と、ゼブラフィッシュの肋骨の成長と石灰化に必要です。"]
[112,30624971,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","(54 puative ciliary genes)","FASEB journal","Mutagenesis of putative ciliary genes with the CRISPR/Cas9 system in zebrafish identifies genes required for retinal development.",2019,"33(4):5248-5256","[Hu R et al.]","Tongji University, Shanghai, China.",30624971,"10.1096/fj.201802140R ","Cilia are conserved microtubule-based organelles that function as mechanical and  chemical sensors in various cell types. By bioinformatic, genomic, and proteomic  studies, more than 2000 proteins have been identified as cilium-associated proteins or putative ciliary proteins; these proteins are referred to as the ciliary proteome or the ciliome. However, little is known about the function of these numerous putative ciliary proteins in cilia. To identify the possible new functional proteins or pathways in cilia, we carried out a small-scale genetic screen targeting 54 putative ciliary genes by using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system. We successfully constructed 54 zebrafish mutants, and 8 of them displayed microphthalmias. Three of these 8 genes encode proteins for protein transport, suggesting the important roles of protein transport in retinal development. In situ hybridization revealed that all these genes are expressed in zebrafish eyes. Furthermore, polo-like kinase 1 was required for ciliogenesis in neural tube. We  uncovered the potential function of the ciliary genes for the retinal development of zebrafish.-Hu, R., Huang, W., Liu, J., Jin, M., Wu, Y., Li, J., Wang, J., Yu,  Z., Wang, H., Cao, Y. Mutagenesis of putative ciliary genes with the CRISPR/Cas9  system in zebrafish identifies genes required for retinal development.","fish","Ciliaは、保存された微小管ベースのオルガネラであり、さまざまな細胞タイプで機械的および化学的センサーとして機能します。バイオインフォマティクス、ゲノム、およびプロテオミクスの研究により、2000を超えるタンパク質が繊毛関連タンパク質または推定毛様体タンパク質として同定されています。これらのタンパク質は、毛様体プロテオームまたは毛様体と呼ばれます。しかし、繊毛におけるこれらの多数の推定繊毛タンパク質の機能についてはほとんど知られていない。繊毛における可能性のある新しい機能性タンパク質または経路を特定するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）システムを使用して、54の推定繊毛遺伝子を標的とする小規模な遺伝子スクリーニングを実施しました。54のゼブラフィッシュ変異体の構築に成功し、そのうち8つは微小眼炎を示しました。これらの8つの遺伝子のうち3つは、タンパク質輸送のためのタンパク質をコードしており、網膜の発達におけるタンパク質輸送の重要な役割を示唆しています。インサイチュハイブリダイゼーションは、これらすべての遺伝子がゼブラフィッシュの眼で発現していることを明らかにした。さらに、ポロ様キナーゼ1は神経管の毛様体形成に必要でした。ゼブラフィッシュの網膜発達のための繊毛遺伝子の潜在的な機能を明らかにしました-Hu、R.、Huang、W.、Liu、J.、Jin、M.、Wu、Y.、Li、J.、Wang、J 。、Yu、Z.、Wang、H.、Cao、Y。ゼブラフィッシュのCRISPR / Cas9システムによる推定繊毛遺伝子の突然変異誘発は、網膜の発達に必要な遺伝子を特定します。"]
[113,30475641,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","fibroblast growth factor receptor 1 oncogene partner-related protein of 20 kDa (for20)","FASEB journal","Centrosomal protein FOR20 is essential for cilia-dependent development in zebrafish embryos.",2019,"33(3):3613-3622","[Xie S et al.]","Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, China.",30475641,"10.1096/fj.201801235RR ","Centrosomal proteins play critical roles in ciliogenesis. Mutations in many centrosomal proteins have been documented to contribute to developmental defects  and cilium-related diseases. Centrosomal protein fibroblast growth factor receptor 1 oncogene partner-related protein of 20 kDa (FOR20) is crucial for ciliogenesis in mammalian cells and the unicellular eukaryote Paramecium; however, the biologic significance of FOR20 in vertebrate development remains unclear. We cloned the zebrafish homolog of the for20 gene and found that for20 mRNA is enriched in ciliated tissues during early zebrafish development. Knockdown of for20 by morpholino oligonucleotides in zebrafish results in multiple ciliary phenotypes, including curved body, hydrocephaly, pericardial edema, kidney cysts, and left-right asymmetry defects. for20 morphants show reduced number and length of cilia in Kupffer's vesicle and pronephric ducts. High-speed video microscopy reveals that cilia in most for20 morphants are consistently paralyzed or beat arrhythmically. To confirm the ciliary phenotypes  of for20 morphants, we used the CRISPR/Cas9 system to disrupt for20 gene in zebrafish. for20 mutants exhibit multiple ciliary phenotypes resembling the defects in for20 morphants. All of these phenotypes in for20 morphants and mutants are significantly reversed by exogenous expression of for20 mRNA. Taken together, these data suggest that FOR20 is required for cilium-mediated processes during zebrafish embryogenesis.-Xie, S., Jin, J., Xu, Z., Huang, Y., Zhang, W., Zhao, L., Lo, L. J., Peng, J., Liu, W., Wang, F., Shu, Q., Zhou, T. Centrosomal protein FOR20 is essential for cilia-dependent development in zebrafish embryos.","fish","中心体タンパク質は、毛様体形成において重要な役割を果たします。多くのセントロソームタンパク質の変異は、発達障害およびシリウム関連疾患に寄与することが報告されています。20 kDaのセントロソームタンパク質線維芽細胞成長因子受容体1腫瘍遺伝子パートナー関連タンパク質（FOR20）は、哺乳動物細胞および単細胞真核生物パラメシウムの繊毛形成に重要です。ただし、脊椎動物の発達におけるFOR20の生物学的重要性は不明なままです。for20遺伝子のゼブラフィッシュホモログをクローン化し、for20mRNAが初期のゼブラフィッシュの発達中に繊毛組織に富むことを発見しました。ゼブラフィッシュのモルホリノオリゴヌクレオチドによるfor20のノックダウンは、湾曲した体、水頭症、心膜浮腫、腎臓嚢胞、左右非対称性の欠陥など、複数の繊毛表現型をもたらします。for20モルファントは、クッパー細胞の小胞と前腎管の繊毛の数と長さが減少していることを示しています。高速ビデオ顕微鏡は、ほとんどのfor20モルファントの繊毛が一貫して麻痺しているか、不規則に鼓動していることを明らかにしています。for20変異体の繊毛表現型を確認するために、CRISPR / Cas9システムを使用してゼブラフィッシュのfor20遺伝子を破壊しました。for20変異体は、for20変異体の欠陥に似た複数の繊毛表現型を示します。for20の変異体および変異体におけるこれらの表現型はすべて、for20mRNAの外因性発現によって有意に逆転します。まとめると、これらのデータは、FOR20がゼブラフィッシュの胚発生中の繊毛媒介プロセスに必要であることを示唆しています-Xie、S.、Jin、J.、Xu、Z.、Huang、Y.、Zhang、W.、Zhao、L。、 Lo、LJ、Peng、J.、Liu、W.、Wang、F.、Shu、Q.、Zhou、T。中心体タンパク質FOR20は、ゼブラフィッシュ胚の繊毛依存性発生に不可欠です。"]
[114,31678534,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","tlx1","Fish & shellfish immunology","Congenital asplenia due to a tlx1 mutation reduces resistance to Aeromonas hydrophila infection in zebrafish.",2019,"95:538-545","[Xie L et al.]","Southwest University, Chongqing, China.",31678534,"10.1016/j.fsi.2019.10.065 ","It is documented that tlx1, an orphan homeobox gene, plays critical roles in the  regulation of early spleen developmental in mammalian species. However, there is  no direct evidence supporting the functions of tlx1 in non-mammalian species, especially in fish. In this study, we demonstrated that tlx1 is expressed in the  splenic primordia as early as 52hours post-fertilization (hpf) in zebrafish. A tlx1(-/-) homozygous mutant line was generated via CRISPR/Cas9 to elucidate the roles of tlx1 in spleen development in zebrafish. In the tlx1(-/-) background, tlx1(-/-) cells persisted in the splenic primordia until 52 hpf but were no longer detectable after 53 hpf, suggesting perturbation of early spleen development. The zebrafish also exhibited congenital asplenia caused by the tlx1  mutation. Asplenic zebrafish can survive and breed normally under standard laboratory conditions, but the survival rate of animals infected with Aeromonas hydrophila was significantly lower than that of wild-type (WT) zebrafish. In asplenic zebrafish, the mononuclear phagocyte system was partially impaired, as demonstrated by retarded b7r expression and reduced ccr2 expression after injection with an inactivated A. hydrophila vaccine. Furthermore, the expression  of MHCII/IgM was significantly reduced in the congenitally asplenic fish compared with that of the WT zebrafish. Taken together, our data suggest that tlx1 is a crucial regulator of spleen development in fish, as it is in mammals. We have also provided a new perspective for studying the role of the spleen during pathogen challenge in fish.","fish","孤児のホメオボックス遺伝子であるtlx1は、哺乳動物種の初期脾臓発達の調節に重要な役割を果たすことが文書化されています。ただし、非哺乳類種、特に魚のtlx1の機能をサポートする直接的な証拠はありません。この研究では、ゼブラフィッシュの受精後52時間（hpf）にtlx1が脾臓原始で発現することを示しました。tlx1（-/-）ホモ接合変異株は、ゼブラフィッシュの脾臓の発達におけるtlx1の役割を解明するためにCRISPR / Cas9を介して生成されました。tlx1（-/-）バックグラウンドでは、tlx1（-/-）細胞は、脾臓原始で52 hpfまで持続しましたが、53 hpf以降は検出できなくなり、初期の脾臓発達の混乱を示唆しています。ゼブラフィッシュはまた、tlx1突然変異によって引き起こされる先天性無脾症を示しました。脾臓ゼブラフィッシュは、標準的な実験室条件下で正常に生存および繁殖できますが、Aeromonas Hydrophilaに感染した動物の生存率は、野生型（WT）ゼブラフィッシュよりも有意に低かった。無脾ゼブラフィッシュでは、不活化A. Hydrophilaワクチンの注射後、b7rの発現が遅延し、ccr2の発現が低下することからわかるように、単核貪食細胞系が部分的に損なわれていました。さらに、MHCII / IgMの発現は、WTゼブラフィッシュと比較して先天性無脾魚で有意に減少しました。まとめると、私たちのデータは、tlx1が哺乳類と同様に、魚の脾臓発達の重要な調節因子であることを示唆しています。また、魚の病原体チャレンジ中の脾臓の役割を研究するための新しい視点を提供しました。"]
[115,31271837,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","Notch1a","Fish & shellfish immunology","Notch1a can widely mediate innate immune responses in zebrafish larvae infected with Vibrio parahaemolyticus.",2019,"92:680-689","[Ji C et al.]","Shanghai Ocean University, Shanghai, China.",31271837,"10.1016/j.fsi.2019.06.058 ","The Notch signaling pathway is known to regulate innate immunity by influencing macrophage function and interacting with the Toll-like receptor (TLR) signaling pathway. However, the comprehensive role of the Notch signaling pathway in the innate immune response remains unknown. To assess the function of Notch1a in immunity, we examined the innate immune responses to Vibrio parahaemolyticus strain Vp13 of wild-type (WT) and notch1a(-/-) zebrafish larvae generated using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system. The median lethal dose (LD50) of V. parahaemolyticus was significantly lower in notch1a(-/-) larvae than in WT larvae 3 days post fertilization (dpf). Transcriptome data analysis revealed 359 significantly differentially expressed genes (DEGs), including 246 significantly  down-regulated genes and 113 significantly up-regulated genes, in WT infected groups compared with WT control groups. In contrast, 986 significantly DEGs were  found in notch1a(-/-) infected groups compared with notch1a(-/-) control groups,  of which 82 genes were significantly down-regulated and 904 genes were significantly up-regulated. These DEGs belonged to the tumor necrosis factor (TNF), complement, nuclear factor kappa B (NF-kappaB), cathepsin, interleukin (IL), chemokine, serpin peptidase inhibitor, matrix metallopeptidase, innate immune cells, pattern recognition receptor (PRR), and other cytokine families. Our results indicate that Notch1a plays roles in inhibiting many immunity-related genes and could comprehensively mediate the innate immune response by regulating  TLRs, nucleotide-binding-oligomerization-domain-like receptors (NLRs), lectins, complement, ILs, chemokines, TNF, cathepsin, and serpin. Further studies are required to understand the specific mechanism of Notch1a in innate immunity.","fish","Notchシグナル伝達経路は、マクロファージ機能に影響を与え、Toll様受容体（TLR）シグナル伝達経路と相互作用することにより、自然免疫を調節することが知られています。ただし、自然免疫応答におけるNotchシグナル伝達経路の包括的な役割は不明なままです。免疫におけるNotch1aの機能を評価するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9を使用して生成された野生型（WT）およびnotch1a（-/-）ゼブラフィッシュ幼虫の腸炎ビブリオVp13株に対する生来の免疫応答を調べました。 （CRISPR / Cas9）システム。V. parahaemolyticusの致死量の中央値（LD50）は、受精3日後（dpf）のWT幼虫よりもnotch1a（-/-）幼虫の方が有意に低かった。トランスクリプトームデータ分析により、WTコントロールグループと比較して、WT感染グループでは、246の有意にダウンレギュレートされた遺伝子と113の有意にアップレギュレートされた遺伝子を含む359の有意に差次的に発現する遺伝子（DEG）が明らかになりました。対照的に、notch1a（-/-）コントロールグループと比較して、notch1a（-/-）感染グループでは986の有意なDEGが見られ、そのうち82の遺伝子が有意にダウンレギュレートされ、904の遺伝子が有意にアップレギュレートされました。これらのDEGは、腫瘍壊死因子（TNF）、補体、核因子カッパB（NF-カッパB）、カテプシン、インターロイキン（IL）、ケモカイン、セルピンペプチダーゼ阻害剤、マトリックスメタロペプチダーゼ、生来の免疫細胞、パターン認識受容体（PRR）に属していました。 、およびその他のサイトカインファミリー。私たちの結果は、Notch1aが多くの免疫関連遺伝子の阻害に役割を果たし、TLR、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体（NLR）、レクチン、補体、IL、ケモカイン、TNFを調節することにより、生来の免疫応答を包括的に媒介できることを示しています。カテプシン、およびセルピン。先天性免疫におけるNotch1aの特定のメカニズムを理解するには、さらなる研究が必要です。"]
[116,30742890,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","gcsfr","Fish & shellfish immunology","Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection  in zebrafish larvae.",2019,"87:565-572","[Wang Z et al.]","East China University of Science  and Technology, Shanghai, China.",30742890,"10.1016/j.fsi.2019.02.008 ","Edwardsiella piscicida is a facultative intracellular pathogen that causes hemorrhagic septicemia and haemolytic ascites disease in aquaculture fish. During bacterial infection, macrophages and neutrophils are the first line of host innate immune system. However, the role of neutrophils in response to E. piscicida infection in vivo remains poorly understood. Here, through developing an immersion infection model in the 5 day-post fertilization (dpf) zebrafish larvae, we found that E. piscicida was mainly colonized in intestine, and resulted into significant pathological changes in paraffin sections. Moreover, a  dynamic up-regulation of inflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-1beta, GCSFb, CXCL8 and MMP9) was detected in zebrafish larvae during E. piscicida infection. Furthermore, a significant recruitment of neutrophils was observed during the E.  piscicida infection in Tg(mpx:eGFP) zebrafish larvae. Thus, we utilized the CRISPR/Cas9 system to generate the neutrophil-knockdown (gcsfr(-/-) crispants) larvae, and found a comparative higher mortality and bacterial colonization in gcsfr(-/-) crispants, which reveals the critical role of fish neutrophils in bacterial clearance. Taken together, our results developed an effective E. piscicida immersion challenge model in zebrafish larvae to clarify the dynamic of bacterial infection in vivo, which would provide a better understanding of the action about innate immune cells during infection.","fish","Edwardsiella piscicidaは、水産養殖魚に出血性敗血症および溶血性腹水症を引き起こす通性細胞内病原体です。細菌感染の間、マクロファージと好中球は宿主の生来の免疫系の第一線です。ただし、invivoでのE.piscicida感染に応答した好中球の役割はよくわかっていません。ここでは、受精後5日（dpf）のゼブラフィッシュ幼虫で浸漬感染モデルを開発することにより、E。piscicidaが主に腸にコロニーを形成し、パラフィン切片に有意な病理学的変化をもたらすことを発見しました。さらに、炎症性サイトカイン（TNF-alpha、IL-1beta、GCSFb、CXCL8、およびMMP9）の動的なアップレギュレーションが、E。piscicida感染中にゼブラフィッシュの幼虫で検出されました。さらに、Tg（mpx：eGFP）ゼブラフィッシュ幼虫のE. piscicida感染中に、好中球の有意な動員が観察されました。したがって、CRISPR / Cas9システムを利用して好中球ノックダウン（gcsfr（-/-）クリスパント）幼虫を生成し、gcsfr（-/-）クリスパントの死亡率と細菌コロニー形成が比較的高いことを発見しました。バクテリアクリアランスにおける魚の好中球。まとめると、私たちの結果は、ゼブラフィッシュの幼虫における効果的なE. piscicida浸漬チャレンジモデルを開発し、in vivoでの細菌感染のダイナミクスを明らかにしました。これにより、感染中の生来の免疫細胞に関する作用をよりよく理解できます。"]
[117,31673996,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","ghrelin","Fish physiology and biochemistry","Brain transcriptome profile after CRISPR-induced ghrelin mutations in zebrafish.",2019,null,"[Blanco AM et al.]","Universidad Complutense de Madrid, Madrid, Spain.",31673996,"10.1007/s10695-019-00687-6 ","Ghrelin (GRL) is a gut-brain hormone with a role in a wide variety of physiological functions in mammals and fish, which points out the ghrelinergic system as a key element for the appropriate biological functioning of the organism. However, many aspects of the multifunctional nature of GRL remain to be better explored, especially in fish. In this study, we used the CRISPR/Cas9 genome editing technique to generate F0 zebrafish in which the expression of grl  is compromised. Then, we employed high-throughput mRNA sequencing (RNA-seq) to explore changes in the brain transcriptome landscape associated with the silencing of grl. The CRISPR/Cas9 technique successfully edited the genome of F0  zebrafish resulting in individuals with considerably lower levels of GRL mRNAs and protein and ghrelin O-acyl transferase (goat) mRNAs in the brain, intestine,  and liver compared to wild-type (WT) zebrafish. Analysis of brain transcriptome revealed a total of 1360 differentially expressed genes (DEGs) between the grl knockdown (KD) and WT zebrafish, with 664 up- and 696 downregulated DEGs in the KD group. Functional enrichment analysis revealed that DEGs are highly enriched for terms related to morphogenesis, metabolism (especially of lipids), entrainment of circadian clocks, oxygen transport, apoptosis, and response to stimulus. The present study offers valuable information on the central genes and  pathways implicated in functions of GRL, and points out the possible involvement  of this peptide in some novel functions in fish, such as apoptosis and oxygen transport.","fish","グレリン（GRL）は、哺乳類や魚のさまざまな生理学的機能に関与する腸脳ホルモンであり、グレリン作動系が生物の適切な生物学的機能の重要な要素であることを示しています。ただし、GRLの多機能性の多くの側面は、特に魚において、まだ十分に調査されていません。この研究では、CRISPR / Cas9ゲノム編集技術を使用して、grlの発現が損なわれたF0ゼブラフィッシュを生成しました。次に、ハイスループットmRNAシーケンス（RNA-seq）を使用して、grlのサイレンシングに関連する脳トランスクリプトームランドスケープの変化を調査しました。CRISPR / Cas9技術は、F0ゼブラフィッシュのゲノムの編集に成功し、野生型（WT）と比較して、脳、腸、肝臓のGRL mRNAとタンパク質およびグレリンO-アシルトランスフェラーゼ（ヤギ）mRNAのレベルがかなり低い個体をもたらしました。ゼブラフィッシュ。脳トランスクリプトームの分析により、grlノックダウン（KD）とWTゼブラフィッシュの間で合計1360の差次的に発現する遺伝子（DEG）が明らかになり、KDグループでは664のアップレギュレートされたDEGと696のダウンレギュレートされたDEGがありました。機能強化分析により、DEGは、形態形成、代謝（特に脂質）、サーカディアンクロックのエントレインメント、酸素輸送、アポトーシス、および刺激への応答に関連する用語について高度に強化されていることが明らかになりました。本研究は、GRLの機能に関係する中心的な遺伝子と経路に関する貴重な情報を提供し、アポトーシスや酸素輸送など、魚のいくつかの新しい機能にこのペプチドが関与している可能性を指摘しています。"]
[118,30940554,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","lymphocyte cytosolic protein 1 (lcp1, also called L-plastin)","Gene expression patterns","Identification of regulatory elements recapitulating early expression of L-plastin in the zebrafish enveloping layer and embryonic periderm.",2019,"32:53-66","[Baumgartner EA et al.]","DePaul University, USA.",30940554,"10.1016/j.gep.2019.03.001 ","We have cloned and characterized an intronic fragment of zebrafish lymphocyte cytosolic protein 1 (lcp1, also called L-plastin) that drives expression to the zebrafish enveloping layer (EVL). L-plastin is a calcium-dependent actin-bundling protein belonging to the plastin/fimbrin family of proteins, and is necessary for the proper migration and attachment of several adult cell types, including leukocytes and osteoclasts. However, in zebrafish lcp1 is abundantly expressed much earlier, during differentiation of the EVL. The cells of this epithelial layer migrate collectively, spreading vegetally over the yolk. L-plastin expression persists into the larval periderm, a transient epithelial tissue that  forms the first larval skin. This finding establishes that L-plastin is activated in two different embryonic waves, with a distinct regulatory switch between the early EVL and the later leukocyte. To better study L-plastin expressing cells we  attempted CRISPR/Cas9 homology-driven recombination (HDR) to insert a self-cleaving peptide (Cre-P2A-EGFP-CAAX) downstream of the native lcp1 promoter. This produced a stable zebrafish line expressing Cre recombinase in EVL nuclei and green fluorescence in EVL cell membranes. In vivo tracking of these labeled cells provided enhanced views of EVL migration behavior, membrane extensions, and mitotic events. Finally, we experimentally dissected key elements of the targeted lcp1 locus, discovering a approximately 300 bp intronic sequence sufficient to drive EVL expression. The lcp1: Cre-P2A-EGFP-CAAX zebrafish should be useful for  studying enveloping layer specification, gastrulation movements and periderm development in this widely used vertebrate model. In addition, the conserved regulatory sequences we have isolated predict that L-plastin orthologs may have a similar early expression pattern in other vertebrate embryos.","fish","ゼブラフィッシュエンベロープ層（EVL）への発現を促進するゼブラフィッシュリンパ球サイトゾルタンパク質1（lcp1、L-プラスチンとも呼ばれる）のイントロニックフラグメントをクローン化し、特性評価しました。L-プラスチンは、プラスチン/フィンブリンファミリーのタンパク質に属するカルシウム依存性のアクチンバンドルタンパク質であり、白血球や破骨細胞を含むいくつかの成体細胞タイプの適切な移動と付着に必要です。しかし、ゼブラフィッシュでは、LCP1はEVLの分化中にはるかに早く発現します。この上皮層の細胞は集合的に移動し、卵黄全体に植物的に広がります。L-プラスチンの発現は、最初の幼虫の皮膚を形成する一過性の上皮組織である幼虫の周皮に持続します。この発見は、L-プラスチンが2つの異なる胚波で活性化され、初期のEVLと後期の白血球の間で明確な調節スイッチがあることを立証しています。L-プラスチン発現細胞をよりよく研究するために、CRISPR / Cas9相同性駆動組換え（HDR）を試みて、ネイティブlcp1プロモーターの下流に自己切断ペプチド（Cre-P2A-EGFP-CAAX）を挿入しました。これにより、EVL核でCreリコンビナーゼを発現し、EVL細胞膜で緑色の蛍光を発現する安定したゼブラフィッシュ系統が生成されました。これらの標識された細胞のインビボ追跡は、EVL遊走挙動、膜伸長、および有糸分裂イベントの強化されたビューを提供しました。最後に、ターゲットのlcp1遺伝子座の重要な要素を実験的に分析し、EVLの発現を促進するのに十分な約300bpのイントロニック配列を発見しました。lcp1：Cre-P2A-EGFP-CAAXゼブラフィッシュは、この広く使用されている脊椎動物モデルで、エンベロープ層の仕様、胃の動き、および周囲の発達を研究するのに役立つはずです。さらに、我々が単離した保存された調節配列は、L-プラスチンオルソログが他の脊椎動物の胚において同様の初期発現パターンを有する可能性があることを予測している。"]
[119,30951722,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type-1 motif, member 9 (adamts9)","General and comparative endocrinology","Adamts9 is necessary for ovarian development in zebrafish.",2019,"277:130-140","[Carter NJ et al.]","East Carolina University, Greenville, NC, USA.",30951722,"10.1016/j.ygcen.2019.04.003 ","Expression of adamts9 (A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type-1 motif, member 9) increases dramatically in the somatic cells surrounding oocytes during ovulation in vertebrates from zebrafish to human. However, the function of Adamts9 during ovulation has not been determined due to the embryonic lethality of knockouts in mice and Drosophila. To identify the role of Adamts9 during ovulation we generated knockout (adamts9(-/-)) zebrafish using CRISPR/Cas9 and characterized the effects of the mutation. From 1047 fish generated by crossing adamts9(+/-) pairs, we found significantly fewer adult adamts9(-/-) fish (4%) than predicted by Mendelian ratios (25%). Of the mutants found, there was a  significant male bias (82%). Only 3 female mutants were identified (7%), and they had small ovaries with few stage III and IV oocytes compared to wildtype (wt) counterparts of comparable size and age. Astoundingly, the remaining mutants (11%) did not appear to have normal testis or ovaries. Instead there was a pair of transparent, ovarian-like membranous shells that filled the abdominal cavity.  Histological examination confirmed that shells were largely empty with no internal structure. Surprisingly, seminiferous tubules and various spermatocytes  including mature spermatozoa were observed on the periphery of these transparent  shells. No female or female like knockouts were observed to release eggs, and no  ovulated oocytes were observed in histological sections. To our knowledge, this is the first report of an adamts9 global knockout model in any adult vertebrates  and the first description of how gonadal sex and structure are affected- highlighting the importance of Adamts9 during gonadal development and the value of zebrafish as a model organism.","fish","アダムツ9（トロンボスポンジン1型モチーフのディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ、メンバー9）の発現は、ゼブラフィッシュからヒトまでの脊椎動物の排卵中に、卵細胞を取り巻く体細胞で劇的に増加します。ただし、排卵中のAdamts9の機能は、マウスとショウジョウバエのノックアウトの胚致死性のために決定されていません。排卵中のAdamts9の役割を特定するために、CRISPR / Cas9を使用してノックアウト（adamts9（-/-））ゼブラフィッシュを生成し、変異の影響を特徴づけました。adamts9（+/-）ペアを交差させることによって生成された1047匹の魚から、メンデル比（25％）によって予測されたよりも有意に少ない成体adamts9（-/-）魚（4％）が見つかりました。見つかった変異体のうち、有意な男性バイアスがありました（82％）。3つの女性変異体のみが同定され（7％）、同等のサイズと年齢の野生型（wt）の対応物と比較して、ステージIIIおよびIVの卵母細胞がほとんどない小さな卵巣がありました。驚くべきことに、残りの変異体（11％）は、正常な精巣または卵巣を持っているようには見えませんでした。代わりに、腹部の空洞を埋める一対の透明な卵巣のような膜状の殻がありました。組織学的検査により、殻はほとんど空であり、内部構造がないことが確認されました。驚いたことに、これらの透明な殻の周辺には、精細管と成熟精子を含むさまざまな精母細胞が観察されました。ノックアウトのような女性または女性が卵を放出することは観察されず、組織切片では排卵した卵母細胞は観察されなかった。私たちの知る限り、これは成人の脊椎動物におけるadamts9グローバルノックアウトモデルの最初の報告であり、性腺の性別と構造がどのように影響を受けるかについての最初の説明であり、性腺発達中のAdamts9の重要性とモデル生物としてのゼブラフィッシュの価値を強調しています。"]
[120,31582646,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","integrin alpha4","Genes & genetic systems","Disruption of integrin alpha4 in zebrafish leads to cephalic hemorrhage during development.",2019,"94(4):177-179","[Iida A et al.]","Kyoto University, Kyoto, Japan.",31582646,"10.1266/ggs.19-00033 ","Integrins, transmembrane molecules that facilitate cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions, are heterodimers that consist of an alpha- and beta-subunit. The integrin alpha4 gene (itgalpha4) is expressed in various type of cells and tissues. Its biochemical functions and physiological roles have been revealed using cultured cell assays. In contrast, the primary effect caused by itgalpha4 deletion on vertebrate development is poorly understood, because knockout mice exhibit multiple defects that can lead to embryonic lethality in the uterus. Zebrafish are a convenient vertebrate model to investigate morphogenesis during embryogenesis, because of their external fertilization and subsequent development outside the female's body. Here, we generated a zebrafish mutant line named itgalpha4 (ko108) using the CRISPR/Cas9 genome editing system; the mutant genome harbored an approximately 2.0-kb deletion in the itgalpha4 locus. A truncated transcript was detected in itgalpha4 (+/-) or (-/-) fish but not in (+/+) fish. The mutant transcript was hypothesized to encode a truncated Itgalpha4 protein due to a premature stop codon. itgalpha4  (-/-) embryos obtained from the mating of heterozygous parents exhibited no apparent phenotype during development at 24 hours post-fertilization (hpf). However, approximately half of them exhibited cephalic hemorrhage at 48 hpf. The  incidence ratio was significantly higher than that in (+/+) or (+/-) embryos. Embryonic hemorrhage has also been reported previously in Itgalpha4 knockout mice. In contrast, embryonic lethality with the other defects reported in the knockout mice was not observed in our zebrafish model. Therefore, the mutant line itgalpha4 (ko108) should be a useful model to investigate a physiological function for Itgalpha4 in the blood circulation system.","fish","インテグリンは、細胞間および細胞間マトリックスの相互作用を促進する膜貫通分子であり、アルファサブユニットとベータサブユニットで構成されるヘテロダイマーです。インテグリンalpha4遺伝子（itgalpha4）は、さまざまな種類の細胞や組織で発現しています。その生化学的機能と生理学的役割は、培養細胞アッセイを使用して明らかにされています。対照的に、ノックアウトマウスは子宮内の胚の致死性につながる可能性のある複数の欠陥を示すため、脊椎動物の発達に対するitgalpha4の欠失によって引き起こされる主な影響はよくわかっていません。ゼブラフィッシュは、外部受精とその後の女性の体外での発達のために、胚形成中の形態形成を調査するための便利な脊椎動物モデルです。ここでは、CRISPR / Cas9ゲノム編集システムを使用して、itgalpha4（ko108）という名前のゼブラフィッシュ変異株を生成しました。変異ゲノムは、itgalpha4遺伝子座に約2.0kbの欠失を持っていました。itgalpha4（+/-）または（-/-）の魚では切り捨てられた転写産物が検出されましたが、（+ / +）の魚では検出されませんでした。変異体転写物は、停止コドンが時期尚早であるため、切り捨てられたItgalpha4タンパク質をコードすると仮定されました。ヘテロ接合の親の交配から得られたitgalpha4（-/-）胚は、受精後24時間（hpf）の発生中に明らかな表現型を示さなかった。しかし、それらの約半分は48hpfで頭位出血を示した。発生率は（+ / +）または（+/-）胚よりも有意に高かった。胚性出血は、Itgalpha4ノックアウトマウスでも以前に報告されています。対照的に、ノックアウトマウスで報告された他の欠陥を伴う胚の致死性は、ゼブラフィッシュモデルでは観察されませんでした。したがって、変異株itgalpha4（ko108）は、血液循環系におけるItgalpha4の生理学的機能を調査するための有用なモデルとなるはずです。"]
[121,30924555,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","41 genes involved in various aspects of MG cell morphogenesis; etc.","Glia","Genetic control of cellular morphogenesis in Muller glia.",2019,"67(7):1401-1411","[Charlton-Perkins M et al.]","University of Cambridge,  Cambridge, UK.",30924555,"10.1002/glia.23615 ","Cell shape is critical for the proper function of every cell in every tissue in the body. This is especially true for the highly morphologically diverse neural and glia cells of the central nervous system. The molecular processes by which these, or indeed any, cells gain their particular cell-specific morphology remain largely unexplored. To identify the genes involved in the morphogenesis of the principal glial cell type in the vertebrate retina, the Muller glia (MG), we used genomic and CRISPR based strategies in zebrafish (Danio rerio). We identified 41  genes involved in various aspects of MG cell morphogenesis and revealed a striking concordance between the sequential steps of anatomical feature addition  and the expression of cohorts of functionally related genes that regulate these steps. We noted that the many of the genes preferentially expressed in zebrafish  MG showed conservation in glia across species suggesting evolutionarily conserved glial developmental pathways.","fish","細胞の形は、体内のすべての組織のすべての細胞が適切に機能するために重要です。これは、中枢神経系の非常に形態学的に多様な神経細胞およびグリア細胞に特に当てはまります。これらの、または実際に任意の細胞が特定の細胞特異的形態を獲得する分子プロセスは、ほとんど未踏のままです。脊椎動物の網膜であるミュラーグリア（MG）の主要なグリア細胞型の形態形成に関与する遺伝子を特定するために、ゼブラフィッシュ（Daniorerio）でゲノムおよびCRISPRベースの戦略を使用しました。MG細胞の形態形成のさまざまな側面に関与する41の遺伝子を特定し、解剖学的特徴の追加の一連のステップと、これらのステップを制御する機能的に関連する遺伝子のコホートの発現との間の顕著な一致を明らかにしました。ゼブラフィッシュMGで優先的に発現する遺伝子の多くは、種を超えてグリア細胞の保存を示し、進化的に保存されたグリア細胞の発達経路を示唆していることに注目しました。"]
[122,30561643,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","premelanosome protein","Human molecular genetics","Non-Synonymous variants in premelanosome protein (PMEL) cause ocular pigment dispersion and pigmentary glaucoma.",2019,"28(8):1298-1311","[Lahola-Chomiak AA et al.]","University of Alberta, Edmonton AB, Canada.",30561643,"10.1093/hmg/ddy429 ","Pigmentary glaucoma (PG) is a common glaucoma subtype that results from release of pigment from the iris, called pigment dispersion syndrome (PDS), and its deposition throughout the anterior chamber of the eye. Although PG has a substantial heritable component, no causative genes have yet been identified. We  used whole exome sequencing of two independent pedigrees to identify two premelanosome protein (PMEL) variants associated with heritable PDS/PG. PMEL encodes a key component of the melanosome, the organelle essential for melanin synthesis, storage and transport. Targeted screening of PMEL in three independent cohorts (n = 394) identified seven additional PDS/PG-associated non-synonymous variants. Five of the nine variants exhibited defective processing of the PMEL protein. In addition, analysis of PDS/PG-associated PMEL variants expressed in HeLa cells revealed structural changes to pseudomelanosomes indicating altered amyloid fibril formation in five of the nine variants. Introduction of 11-base pair deletions to the homologous pmela in zebrafish by the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 method caused profound pigmentation defects and enlarged anterior segments in the eye, further supporting PMEL's role in ocular pigmentation and function. Taken together, these data support a model in which missense PMEL variants represent dominant negative  mutations that impair the ability of PMEL to form functional amyloid fibrils. While PMEL mutations have previously been shown to cause pigmentation and ocular  defects in animals, this research is the first report of mutations in PMEL causing human disease.","fish","色素性緑内障（PG）は、色素分散症候群（PDS）と呼ばれる虹彩からの色素の放出と、前眼房全体への沈着から生じる一般的な緑内障のサブタイプです。PGにはかなりの遺伝的要素がありますが、原因となる遺伝子はまだ特定されていません。2つの独立した血統の全エクソームシーケンシングを使用して、遺伝性PDS / PGに関連する2つのプレメラノソームタンパク質（PMEL）バリアントを特定しました。PMELは、メラニンの合成、保存、輸送に不可欠なオルガネラであるメラノソームの重要なコンポーネントをエンコードします。3つの独立したコホート（n = 394）でのPMELのターゲットスクリーニングにより、7つの追加のPDS / PG関連の非同義バリアントが特定されました。9つのバリアントのうち5つは、PMELタンパク質の処理の欠陥を示しました。さらに、HeLa細胞で発現したPDS / PG関連PMEL変異体の分析により、偽メラノソームの構造変化が明らかになり、9つの変異体のうち5つでアミロイド線維形成が変化したことが示されました。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）-Cas9法によるゼブラフィッシュの相同pmelaへの11塩基対の欠失の導入は、眼の色素沈着と機能におけるPMELの役割をさらにサポートする深刻な色素沈着欠陥と眼の前眼部の拡大を引き起こしました。まとめると、これらのデータは、ミスセンスPMELバリアントが、PMELが機能的なアミロイド原線維を形成する能力を損なうドミナントネガティブ変異を表すモデルをサポートしています。PMEL変異は動物に色素沈着と眼の欠陥を引き起こすことが以前に示されていましたが、この研究は人間の病気を引き起こすPMELの変異の最初の報告です。"]
[123,30428046,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","deoxyguanosine kinase (dguok)","Human molecular genetics","Nucleoside supplementation modulates mitochondrial DNA copy number in the dguok -/- zebrafish.",2019,"28(5):796-803","[Munro B et al.]","Newcastle University, Newcastle upon Tyne, UK.",30428046,"10.1093/hmg/ddy389 ","Deoxyguanosine kinase (dGK) is an essential rate-limiting component of the mitochondrial purine nucleotide salvage pathway, encoded by the nuclear gene encoding deoxyguanosine kinase (DGUOK). Mutations in DGUOK lead to mitochondrial  DNA (mtDNA) depletion typically in the liver and brain, causing a hepatocerebral  phenotype. Previous work has shown that in cultured DGUOK patient cells it is possible to rescue mtDNA depletion by increasing substrate amounts for dGK. In this study we developed a mutant dguok zebrafish (Danio rerio) line using CRISPR/Cas9 mediated mutagenesis; dguok-/- fish have significantly reduced mtDNA  levels compared with wild-type (wt) fish. When supplemented with only one purine  nucleoside (dGuo), mtDNA copy number in both mutant and wt juvenile animals was significantly reduced, contrasting with previous cell culture studies, possibly because of nucleotide pool imbalance. However, in adult dguok-/- fish we detected a significant increase in liver mtDNA copy number when supplemented with both purine nucleosides. This study further supports the idea that nucleoside supplementation has a potential therapeutic benefit in mtDNA depletion syndromes  by substrate enhancement of the purine nucleoside salvage pathway and might improve the liver pathology in patients.","fish","デオキシグアノシンキナーゼ（dGK）は、ミトコンドリアのプリンヌクレオチドサルベージ経路の必須の律速成分であり、デオキシグアノシンキナーゼ（DGUOK）をコードする核遺伝子によってコードされています。DGUOKの変異は、通常、肝臓と脳でミトコンドリアDNA（mtDNA）の枯渇を引き起こし、肝脳表現型を引き起こします。以前の研究では、培養されたDGUOK患者細胞では、dGKの基質量を増やすことでmtDNAの枯渇を救うことが可能であることが示されています。この研究では、CRISPR / Cas9を介した突然変異誘発を使用して、突然変異体dguokゼブラフィッシュ（Daniorerio）系統を開発しました。dguok-/-魚は、野生型（wt）魚と比較してmtDNAレベルが大幅に低下しています。1つのプリンヌクレオシド（dGuo）のみを補充した場合、おそらくヌクレオチドプールの不均衡のために、以前の細胞培養研究とは対照的に、変異動物とwt幼若動物の両方でmtDNAコピー数が大幅に減少しました。しかし、成体のdguok-/-魚では、両方のプリンヌクレオシドを補充すると、肝臓のmtDNAコピー数の有意な増加が検出されました。この研究はさらに、ヌクレオシド補給がプリンヌクレオシドサルベージ経路の基質増強によるmtDNA枯渇症候群の潜在的な治療上の利益を有し、患者の肝臓病理を改善する可能性があるという考えを支持します。"]
[124,31039421,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","RhoB","International journal of radiation oncology, biology, physics","The Critical Role of Dysregulated RhoB Signaling Pathway in Radioresistance of Colorectal Cancer.",2019,"104(5):1153-1164","[Liu N et al.]","Linkoping University, Linkoping, Sweden.",31039421,"10.1016/j.ijrobp.2019.04.021 ","PURPOSE: To explore whether the Rho protein is involved in the radioresistance of colorectal cancer and investigate the underlying mechanisms. METHODS AND MATERIALS: Rho GTPase expression was measured after radiation treatment in colon  cancer cells. RhoB knockout cell lines were established using the CRISPR/Cas9 system. In vitro assays and zebrafish embryos were used for analyzing radiosensitivity and invasive ability. Mass cytometry was used to detect RhoB downstream signaling factors. RhoB and Forkhead box M1 (FOXM1) expression were detected by immunohistochemistry in rectal cancer patients who participated in a  radiation therapy trial. RESULTS: RhoB expression was related to radiation resistance. Complete depletion of the RhoB protein increased radiosensitivity and impaired radiation-enhanced metastatic potential in vitro and in zebrafish models. Probing signaling using mass cytometry-based single-cell analysis showed  that the Akt phosphorylation level was inhibited by RhoB depletion after radiation. FOXM1 was downregulated in RhoB knockout cells, and the inhibition of  FOXM1 led to lower survival rates and attenuated migration and invasion abilities of the cells after radiation. In the patients who underwent radiation therapy, RhoB overexpression was related to high FOXM1, late Tumor, Node, Metastasis stage, high distant recurrence, and poor survival independent of other clinical factors. CONCLUSIONS: RhoB plays a critical role in radioresistance of colorectal cancer through Akt and FOXM1 pathways.","fish","目的：Rhoタンパク質が結腸直腸癌の放射線耐性に関与しているかどうかを調査し、根本的なメカニズムを調査すること。方法と材料：Rho GTPaseの発現は、結腸癌細胞での放射線治療後に測定されました。RhoBノックアウト細胞株は、CRISPR / Cas9システムを使用して確立されました。放射線感受性と浸潤能を分析するために、invitroアッセイとゼブラフィッシュ胚を使用した。マスサイトメトリーを使用して、RhoB下流シグナル伝達因子を検出しました。RhoBおよびフォークヘッドボックスM1（FOXM1）の発現は、放射線療法の試験に参加した直腸癌患者の免疫組織化学によって検出されました。結果：RhoBの発現は放射線耐性に関連していた。RhoBタンパク質の完全な枯渇は、放射線感受性を増加させ、invitroおよびゼブラフィッシュモデルにおける放射線増強転移能を損なう。マスサイトメトリーベースの単一細胞分析を使用してシグナル伝達を精査すると、Aktリン酸化レベルが放射線照射後のRhoB枯渇によって阻害されることが示された。FOXM1はRhoBノックアウト細胞でダウンレギュレートされ、FOXM1の阻害により、放射線照射後の細胞の生存率が低下し、細胞の遊走および浸潤能力が低下しました。放射線療法を受けた患者では、RhoBの過剰発現は、他の臨床的要因とは無関係に、高いFOXM1、後期腫瘍、結節、転移期、高い遠隔再発、および生存率の低下に関連していた。結論：RhoBは、AktおよびFOXM1経路を介して結腸直腸癌の放射線耐性に重要な役割を果たします。"]
[125,30629186,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","autotaxin (atxa)","Journal of biochemistry","Identification and biochemical characterization of a second zebrafish autotaxin gene.",2019,"165(3):269-275","[Kise R et al.]","Tohoku University, Sendai, Japan.",30629186,"10.1093/jb/mvy114 ","Autotaxin (ATX) is a secreted enzyme that produces a bioactive lysophospholipid,  lysophosphatidic acid (LPA). ATX plays a role in vascular and neural development  in embryos but its mechanisms remain unclear. At the beginning of this study, only one zebrafish atx gene (atxa) was known and had been investigated. In this study, we generated ATX knockout (KO) fish by TALEN targeting atxa. Unexpectedly, atxa KO fish showed neither vascular defects nor reduction of ATX activity, implying the existence of one or more other ATXs in the genome. By a BLAST search using ATXa protein fragments as a query, we found a genomic sequence that closely resembled atxa exons 13, 14 and 15. Consequently, we cloned a cDNA encoding a second zebrafish autotaxin (ATXb), and found that it was transcribed in various tissues. The atxb gene encoded a protein of 832 amino acids (compared to 850 amino acids in ATXa) with 60% amino acid identity to ATXa and clustered with ATXs from other species. A recombinant ATXb protein showed lysophospholipase D (lysoPLD) activities with substrate specificities similar to those of ATXa and mammalian ATXs. These results indicate that ATXb is a second zebrafish ATX, which possibly shares redundant roles with ATXa in embryonic development.","fish","オートタキシン（ATX）は、生理活性のあるリゾリン脂質であるリゾホスファチジン酸（LPA）を生成する分泌酵素です。ATXは胚の血管および神経の発達に役割を果たしていますが、そのメカニズムは不明なままです。この研究の開始時に、1つのゼブラフィッシュatx遺伝子（atxa）のみが知られており、調査されていました。この研究では、atxaをターゲットとするTALENによってATXノックアウト（KO）魚を生成しました。予期せぬことに、atxa KO魚は血管の欠陥もATX活性の低下も示さず、ゲノム内に1つ以上の他のATXが存在することを示唆しています。ATXaタンパク質フラグメントをクエリとして使用したBLAST検索により、atxaエクソン13、14、および15に非常に類似したゲノム配列が見つかりました。その結果、2番目のゼブラフィッシュオートタキシン（ATXb）をコードするcDNAをクローン化し、さまざまな組織。atxb遺伝子は、ATXaと60％のアミノ酸同一性を持ち、他の種のATXとクラスター化した832アミノ酸（ATXaの850アミノ酸と比較して）のタンパク質をコードしていました。組換えATXbタンパク質は、ATXaおよび哺乳類ATXと同様の基質特異性を持つリゾホスホリパーゼD（lysoPLD）活性を示しました。これらの結果は、ATXbが2番目のゼブラフィッシュATXであり、胚発生においてATXaと冗長な役割を共有している可能性があることを示しています。"]
[126,30317609,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","zinc  finger transcription factor 1  (znfl1s)","Journal of cellular physiology","Zebrafish znfl1s regulate left-right asymmetry patterning through controlling the expression of fgfr1a.",2019,"234(3):1987-1995","[Li J et al.]","Women's Hospital of Nanjing Medical  University, China.",30317609,"10.1002/jcp.27564 ","Proper left-right (LR) axis establishment is critical for organogenesis in vertebrates. Previously, we reported that zinc finger transcription factors zinc  finger transcription factor 1 (znfl1s) are expressed in the tailbud and axial mesoderm in zebrafish. However, a role of znfl1s in LR axis development has not been demonstrated. Here, we discovered that the knockdown of znfl1s using morpholino (MO) in whole embryos or dorsal forerunner cells (DFCs) interrupted LR asymmetry and normal development of the heart, liver, and pancreas. Whole-embryo  knockdown of znfl1s by MO or clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) interference (CRISPRi) resulted in the absent expression of nodal gene spaw and Nodal signaling-related genes lft1, lft2, and pitx2c in the left lateral plate mesoderm (LPM), and Spaw, Lft1, Lft2, and Pitx2c play important roles in LR axis development in zebrafish. However, specific knockdown of znfl1s  in DFCs resulted in random expression of spaw, lft1, lft2, and pitx2c. Knockdown  of znfl1s led to abnormal cilia formation by the downregulation of fgfr1a and foxj1a expression. The expression of spaw, lft1, lft2, and pitx2c was partially rescued by the overexpression of fgfr1a mRNA in znfl1s morphants. Taken together, our results suggest that znfl1s regulate laterality development in zebrafish embryos through controlling the expression of fgfr1a.","fish","適切な左右（LR）軸の確立は、脊椎動物の器官形成にとって重要です。以前、ジンクフィンガー転写因子ジンクフィンガー転写因子1（znfl1s）がゼブラフィッシュの尾芽と脊索中胚葉で発現していることを報告しました。ただし、LR軸の開発におけるznfl1sの役割は実証されていません。ここでは、全胚または背側前走細胞（DFC）でモルホリノ（MO）を使用したznfl1のノックダウンが、LRの非対称性と、心臓、肝臓、膵臓の正常な発達を妨げることを発見しました。MOまたはクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）干渉（CRISPRi）によるznfl1sの全胚ノックダウンは、左側板中胚葉における結節遺伝子スポウおよび結節シグナル伝達関連遺伝子lft1、lft2、およびpitx2cの発現の欠如をもたらしました（ LPM）、およびSpaw、Lft1、Lft2、およびPitx2cは、ゼブラフィッシュのLR軸の発達に重要な役割を果たします。ただし、DFCでのznfl1の特定のノックダウンにより、spaw、lft1、lft2、およびpitx2cがランダムに表現されました。znfl1sのノックダウンは、fgfr1aおよびfoxj1aの発現のダウンレギュレーションによって異常な繊毛形成を引き起こしました。spaw、lft1、lft2、およびpitx2cの発現は、znfl1s変異体におけるfgfr1amRNAの過剰発現によって部分的に救済されました。まとめると、我々の結果は、znfl1sがfgfr1aの発現を制御することによってゼブラフィッシュ胚の側性発達を調節することを示唆している。"]
[127,31693487,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","cyp11a2","Journal of endocrinology","The P450 side chain cleavage enzyme Cyp11a2 facilitates steroidogenesis in zebrafish.",2019,null,"[Li N et al.]","University of Sheffield, Sheffield, UK.",31693487,"10.1530/JOE-19-0384 ","The cytochrome P450 side-chain cleavage enzyme, encoded by the CYP11A1 gene, catalyzes the first and rate-limiting step of steroid hormone biosynthesis. Previous morpholino knockdown studies in zebrafish suggested cyp11a2 is a functional equivalent of human CYP11A1 and is essential for interrenal steroidogenesis in zebrafish larvae. The role of Cyp11a2 in adult zebrafish, particularly in gonadal steroidogenesis, remains elusive. To explore the role of  Cyp11a2 in adults, we developed zebrafish mutant lines by creating deletions in cyp11a2 using the CRISPR/Cas9 genomic engineering approach. Homozygous mutant zebrafish larvae showed an upregulation of the hypothalamic-pituitary-interrenal  axis. Furthermore, Cyp11a2-deficient zebrafish demonstrated profound glucocorticoid and androgen deficiencies. Cyp11a2 homozygotes only developed into males with feminized secondary sex characteristics. Adult cyp11a2-/- mutant fish  showed a lack of natural breeding behaviors. Histological characterization revealed disorganized testicular structure and significantly decreased numbers of mature spermatozoa. These findings are further supported by the downregulation of the expression of several pro-male genes in the testes of cyp11a2 homozygous zebrafish, including sox9a, dmrt1 and amh. Moreover, the spermatogonia markers nanos2 and piwil1 were upregulated, while the spermatocytes marker sycp3 and spermatids marker odf3b were downregulated in the testes of cyp11a2 homozygous mutants. Our expression analysis is consistent with our histological studies, suggesting that spermatogonia are the predominant cell types in the testes of cyp11a2 homozygous mutants. Our work thus demonstrates the crucial role of Cyp11a2 in interrenal and gonadal steroidogenesis in zebrafish larvae and adults.","fish","CYP11A1遺伝子によってコードされるチトクロームP450側鎖切断酵素は、ステロイドホルモン生合成の最初の速度制限ステップを触媒します。ゼブラフィッシュでの以前のモルホリノノックダウン研究は、cyp11a2がヒトCYP11A1と機能的に同等であり、ゼブラフィッシュ幼虫の腎間ステロイド産生に不可欠であることを示唆しました。成体ゼブラフィッシュ、特に性腺ステロイド産生におけるCyp11a2の役割は、とらえどころのないままです。成人におけるCyp11a2の役割を調査するために、CRISPR / Cas9ゲノムエンジニアリングアプローチを使用してcyp11a2に欠失を作成することにより、ゼブラフィッシュ変異株を開発しました。ホモ接合変異ゼブラフィッシュの幼生は、視床下部-下垂体-腎間軸のアップレギュレーションを示した。さらに、Cyp11a2欠損ゼブラフィッシュは、深刻なグルココルチコイドおよびアンドロゲン欠損症を示しました。Cyp11a2ホモ接合体は、女性化された第二次性徴を持つ男性にのみ発達しました。成体のcyp11a2-/-変異魚は、自然な繁殖行動の欠如を示しました。組織学的特徴は、無秩序な精巣構造と成熟した精子の数の有意な減少を明らかにした。これらの発見は、sox9a、dmrt1、amhなどのcyp11a2ホモ接合ゼブラフィッシュの精巣におけるいくつかのプロ男性遺伝子の発現のダウンレギュレーションによってさらに裏付けられています。さらに、精原細胞マーカーsycp3および精母細胞マーカーodf3bがcyp11a2ホモ接合変異体の精巣でダウンレギュレートされた一方で、精原細胞マーカーnanos2およびpiwil1はアップレギュレートされました。私たちの発現分析は私たちの組織学的研究と一致しており、精原細胞がcyp11a2ホモ接合変異体の精巣における主要な細胞型であることを示唆しています。したがって、私たちの研究は、ゼブラフィッシュの幼虫および成人の腎間および性腺のステロイド産生におけるCyp11a2の重要な役割を示しています。"]
[128,31562193,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","gba1; gba2","Journal of lipid research","Role of beta-glucosidase 2 in aberrant glycosphingolipid metabolism: model of glucocerebrosidase deficiency in zebrafish.",2019,"60(11):1851-1867","[Lelieveld LT  et al.]","Leiden Institute of Chemistry, Leiden, The Netherlands.",31562193,"10.1194/jlr.RA119000154 ","beta-glucosidases [GBA1 (glucocerebrosidase) and GBA2] are ubiquitous essential enzymes. Lysosomal GBA1 and cytosol-facing GBA2 degrade glucosylceramide (GlcCer); GBA1 deficiency causes Gaucher disease, a lysosomal storage disorder characterized by lysosomal accumulation of GlcCer, which is partly converted to glucosylsphingosine (GlcSph). GBA1 and GBA2 also may transfer glucose from GlcCer to cholesterol, yielding glucosylated cholesterol (GlcChol). Here, we aimed to clarify the role of zebrafish Gba2 in glycosphingolipid metabolism during Gba1 deficiency in zebrafish (Danio rerio), which are able to survive total Gba1 deficiency. We developed Gba1 (gba1 (-/-)), Gba2 (gba2 (-/-)), and double (gba1 (-/-) :gba2 (-/-)) zebrafish knockouts using CRISPR/Cas9 and explored the effects of both genetic and pharmacological interventions on GlcCer metabolism in individual larvae. Activity-based probes and quantification of relevant glycolipid metabolites confirmed enzyme deficiency. GlcSph increased in gba1 (-/-) larvae (0.09 pmol/fish) but did not increase more in gba1 (-/-) :gba2 (-/-) larvae. GlcCer was comparable in gba1 (-/-) and WT larvae but increased in gba2 (-/-) and gba1 (-/-) :gba2 (-/-) larvae. Independent of Gba1 status, GlcChol was  low in all gba2 (-/-) larvae (0.05 vs. 0.18 pmol/fish in WT). Pharmacologic inactivation of zebrafish Gba1 comparably increased GlcSph. Inhibition of GlcCer  synthase (GCS) in Gba1-deficient larvae reduced GlcCer and GlcSph, and concomitant inhibition of GCS and Gba2 with iminosugars also reduced excessive GlcChol. Finally, overexpression of human GBA1 and injection of recombinant GBA1  both decreased GlcSph. We determined that zebrafish larvae offer an attractive model to study glucosidase actions in glycosphingolipid metabolism in vivo, and we identified distinguishing characteristics of zebrafish Gba2 deficiency.","fish","ベータグルコシダーゼ[GBA1（グルコセレブロシダーゼ）およびGBA2]は遍在する必須酵素です。リソソームGBA1およびサイトゾルに面するGBA2は、グルコシルセラミダーゼ（GlcCer）を分解します。GBA1欠損症は、部分的にグルコシルスフィンゴシン（GlcSph）に変換されるGlcCerのリソソーム蓄積を特徴とするリソソーム貯蔵障害であるゴーチャー病を引き起こします。GBA1およびGBA2は、グルコースをGlcCerからコレステロールに移動し、グルコシル化コレステロール（GlcChol）を生成する場合もあります。ここでは、Gba1の総欠乏を乗り切ることができるゼブラフィッシュ（Daniorerio）のGba1欠乏時のグリコスフィンゴ脂質代謝におけるゼブラフィッシュGba2の役割を明らかにすることを目的としました。CRISPR / Cas9を使用してGba1（gba1（-/-））、Gba2（gba2（-/-））、およびdouble（gba1（-/-）：gba2（-/-））ゼブラフィッシュノックアウトを開発し、個々の幼虫のGlcCer代謝に対する遺伝的および薬理学的介入の両方。活動ベースのプローブと関連する糖脂質代謝物の定量化により、酵素の欠乏が確認されました。GlcSphはgba1（-/-）幼虫（0.09 pmol /魚）で増加しましたが、gba1（-/-）：gba2（-/-）幼虫ではそれ以上増加しませんでした。GlcCerはgba1（-/-）とWTの幼虫で同等でしたが、gba2（-/-）とgba1（-/-）：gba2（-/-）の幼虫で増加しました。Gba1の状態とは関係なく、GlcCholはすべてのgba2（-/-）幼虫で低かった（WTで0.05対0.18 pmol /魚）。ゼブラフィッシュGba1の薬理学的不活性化は、GlcSphを同等に増加させました。Gba1欠損幼虫におけるGlcCerシンターゼ（GCS）の阻害は、GlcCerとGlcSphを減少させ、イミノ糖によるGCSとGba2の同時阻害も過剰なGlcCholを減少させました。最後に、ヒトGBA1の過剰発現と組換えGBA1の注射は、両方ともGlcSphを減少させました。我々は、ゼブラフィッシュの幼虫がインビボでのグリコスフィンゴ脂質代謝におけるグルコシダーゼ作用を研究するための魅力的なモデルを提供することを決定し、ゼブラフィッシュのGba2欠損症の際立った特徴を特定した。"]
[129,30461368,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","tardbpl","Journal of neurophysiology","Neuromuscular junction abnormalities in a zebrafish loss-of-function model of TDP-43.",2019,"121(1):285-297","[Bose P  et al.]","Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Universite de Montreal , Montreal, Quebec , Canada.",30461368,"10.1152/jn.00265.2018 ","Almost 90% of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) cases are characterized by the  presence of aggregates of insoluble, misfolded cytoplasmic TAR DNA binding protein of 43 kDa (TDP-43). Distal axonopathy with impaired neuromuscular junctions (NMJs) before motor neuron degeneration or clinical onset of symptoms has been hypothesized as an early pathology in ALS. However, synaptic defects at  the NMJ caused by TDP-43 mutations have not been characterized. In this study, we examined a previously reported zebrafish line expressing the tardbp(Y220X/Y220X)  variant, which results in an unstable and degraded protein. These tardbp(-/-) larvae, however, mature normally due to the upregulated expression of an alternative splice variant of the tardbp paralog tardbp-like, or tardbpl. We generated a mutant line with a CRISPR/Cas9-mediated 5-base pair deletion encompassing the ATG start codon of tardbpl and in-crossed these with tardbp(-/-) mutants to obtain tardbp(-/-) and tardbpl(-/-) double mutants, herein referred to as hom/hom. We subsequently characterized morphological, coiling, locomotor, synaptic, and NMJ structural abnormalities in the hom/hom mutants and in their genotypic controls. We observed that hom/hom mutants displayed gross morphological defects, early lethality, reduced locomotor function, aberrant quantal transmission, and perturbed synapse architecture at the NMJ. We further employed pharmacological manipulations in an effort to rescue phenotypic defects  and observed that tardbp(+/-); tardbpl(-/-) (herein referred to as het/hom) mutants, but not hom/hom mutants, were sensitive to chronic treatments of BAY K 8644, an L-type calcium channel agonist. This result highlights the importance of partial vs. complete loss of allelic functions of TDP-43. NEW & NOTEWORTHY This study highlights the importance of partial vs. complete loss of allelic functions of TDP-43 in a zebrafish loss of function model, thus making it an attractive tool for drug screening approaches.","fish","筋萎縮性側索硬化症（ALS）症例のほぼ90％は、43 kDaの不溶性の誤って折りたたまれた細胞質TAR DNA結合タンパク質（TDP-43）の凝集体の存在を特徴としています。運動ニューロンの変性または症状の臨床的発症の前の神経筋接合部（NMJ）の障害を伴う遠位軸索障害は、ALSの初期の病態として仮定されています。ただし、TDP-43変異によって引き起こされるNMJでのシナプス欠陥は特徴付けられていません。この研究では、以前に報告されたtardbp（Y220X / Y220X）バリアントを発現するゼブラフィッシュ系統を調べました。これにより、タンパク質が不安定で分解されます。ただし、これらのtardbp（-/-）幼虫は、tardbpパラログtardbp-likeまたはtardbplの代替スプライスバリアントの発現がアップレギュレートされているため、正常に成熟します。tardbplのATG開始コドンを含むCRISPR / Cas9を介した5塩基対の欠失を伴う変異株を生成し、これらをtardbp（-/-）変異体と交配して、tardbp（-/-）およびtardbpl（-/ -）本明細書ではhom / homと呼ばれる二重変異体。その後、hom / hom変異体とその遺伝子型コントロールにおける形態学的、コイリング、運動、シナプス、およびNMJの構造異常を特徴づけました。hom / hom変異体は、NMJで、全体的な形態学的欠陥、早期致死、運動機能の低下、異常な量子伝達、およびシナプス構造の乱れを示したことが観察されました。さらに、表現型の欠陥を救済するために薬理学的操作を採用し、そのtardbp（+/-）を観察しました。tardbpl（-/-）（ここではhet / homと呼びます）変異体は、hom / hom変異体ではなく、L型カルシウムチャネルアゴニストであるBAY K8644の慢性治療に感受性がありました。この結果は、TDP-43の対立遺伝子機能の部分的喪失と完全喪失の重要性を浮き彫りにしています。NEW＆NOTEWORTHYこの研究は、ゼブラフィッシュの機能喪失モデルにおけるTDP-43の対立遺伝子機能の部分的喪失と完全喪失の重要性を強調しているため、薬物スクリーニングアプローチの魅力的なツールとなっています。"]
[130,30594530,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","nuclear factor erythroid 2-related factor 2a","Journal of pharmacological and toxicological methods","Increased susceptibility to oxidative stress-induced toxicological evaluation by  genetically modified nrf2a-deficient zebrafish.",2019,"96:34-45","[Yamashita A et al.]","Mie University Graduate School of Medicine, Mie, Japan.",30594530,"10.1016/j.vascn.2018.12.006 ","INTRODUCTION: Oxidative stress plays an important role in drug-induced toxicity.  Oxidative stress-mediated toxicities can be detected using conventional animal models but their sensitivity is insufficient, and novel models to improve susceptibility to oxidative stress have been researched. In recent years, gene targeting methods in zebrafish have been developed, making it possible to generate homozygous null mutants. In this study, we established zebrafish deficient in the nuclear factor erythroid 2-related factor 2a (nrf2a), a key antioxidant-responsive gene, and its potential to detect oxidative stress-mediated toxicity was examined. METHODS: Nrf2a-deficient zebrafish were generated using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 technique. The loss of nrf2a function was confirmed  by the tolerability to hydrogen peroxide and hydrogen peroxide-induced gene expression profiles being related to antioxidant response element (ARE)-dependent signaling. Subsequently, vulnerability of nrf2a-deficient zebrafish to acetaminophen (APAP)- or doxorubicin (DOX)-induced toxicity was investigated. RESULTS: Nrf2a-deficient zebrafish showed higher mortality than wild type accompanied by less induction of ARE-dependent genes with hydrogen peroxide treatment. Subsequently, this model showed increased severity and incidence of APAP-induced hepatotoxicity or DOX-induced cardiotoxicity than wild type. DISCUSSION: Our results demonstrated that anti-oxidative response might not fully function in this model, and resulted in higher sensitivity to drug-induced oxidative stress. Our data support the usefulness of nrf2a-deficient model as a tool for evaluation of oxidative stress-related toxicity in drug discovery research.","fish","はじめに：酸化ストレスは、薬物誘発毒性において重要な役割を果たします。酸化ストレスを介した毒性は、従来の動物モデルを使用して検出できますが、その感度は不十分であり、酸化ストレスに対する感受性を改善するための新しいモデルが研究されています。近年、ゼブラフィッシュの遺伝子ターゲティング法が開発され、ホモ接合のヌル変異体を生成することが可能になりました。この研究では、主要な抗酸化応答遺伝子である核因子赤芽球2関連因子2a（nrf2a）を欠損したゼブラフィッシュを確立し、酸化ストレスを介した毒性を検出する可能性を検討しました。方法：Nrf2a欠損ゼブラフィッシュは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連9技術を使用して生成されました。nrf2a機能の喪失は、酸化防止剤応答要素（ARE）依存性シグナル伝達に関連する過酸化水素および過酸化水素誘導遺伝子発現プロファイルに対する耐性によって確認されました。続いて、アセトアミノフェン（APAP）またはドキソルビシン（DOX）によって誘発される毒性に対するnrf2a欠損ゼブラフィッシュの脆弱性が調査されました。結果：Nrf2a欠損ゼブラフィッシュは、過酸化水素処理によるARE依存性遺伝子の誘導が少ない野生型よりも高い死亡率を示しました。その後、このモデルは、野生型よりもAPAP誘発性肝毒性またはDOX誘発性心臓毒性の重症度と発生率の増加を示しました。考察：我々の結果は、抗酸化反応がこのモデルでは完全には機能しない可能性があり、薬物誘発性酸化ストレスに対する感受性が高くなることを示した。私たちのデータは、薬物発見研究における酸化ストレス関連毒性の評価のためのツールとしてのnrf2a欠損モデルの有用性を裏付けています。"]
[131,30031067,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","col14a1a","Matrix biology","Gene profile of zebrafish fin regeneration offers clues to kinetics, organization and biomechanics of basement membrane.",2019,"75-76:82-101","[Nauroy P et al.]","Universite de Lyon, ENSL, CNRS, Lyon, France.",30031067,"10.1016/j.matbio.2018.07.005 ","How some animals regenerate missing body parts is not well understood. Taking advantage of the zebrafish caudal fin model, we performed a global unbiased time-course transcriptomic analysis of fin regeneration. Biostatistics analyses identified extracellular matrix (ECM) as the most enriched gene sets. Basement membranes (BMs) are specialized ECM structures that provide tissues with structural cohesion and serve as a major extracellular signaling platform. While  the embryonic formation of BM has been extensively investigated, its regeneration in adults remains poorly studied. We therefore focused on BM gene expression kinetics and showed that it recapitulates many aspects of development. As such, the re-expression of the embryonic col14a1a gene indicated that col14a1a is part  of the regeneration-specific program. We showed that laminins and col14a1a genes  display similar kinetics and that the corresponding proteins are spatially and temporally controlled during regeneration. Analysis of our CRISPR/Cas9-mediated col14a1a knockout fish showed that collagen XIV-A contributes to timely deposition of laminins. As changes in ECM organization can affect tissue mechanical properties, we analyzed the biomechanics of col14a1a(-/-) regenerative BM using atomic force microscopy (AFM). Our data revealed a thinner BM accompanied by a substantial increase of the stiffness when compared to controls. Further AFM 3D-reconstructions showed that BM is organized as a checkerboard made of alternation of soft and rigid regions that is compromised in mutants leading to a more compact structure. We conclude that collagen XIV-A transiently acts as  a molecular spacer responsible for BM structure and biomechanics possibly by helping laminins integration within regenerative BM.","fish","一部の動物が失われた体の部分をどのように再生するかはよく理解されていません。ゼブラフィッシュ尾鰭モデルを利用して、鰭再生のグローバルな偏りのない時間経過転写解析を実行しました。生物統計分析により、細胞外マトリックス（ECM）が最も濃縮された遺伝子セットとして特定されました。基盤膜（BM）は、組織に構造的凝集を提供し、主要な細胞外シグナル伝達プラットフォームとして機能する特殊なECM構造です。BMの胚形成は広く研究されてきましたが、成人におけるその再生は十分に研究されていません。したがって、BM遺伝子発現動態に焦点を当て、それが開発の多くの側面を再現することを示しました。このように、胚のcol14a1a遺伝子の再発現は、col14a1aが再生特異的プログラムの一部であることを示しました。ラミニンとcol14a1a遺伝子が同様の動態を示し、対応するタンパク質が再生中に空間的および時間的に制御されることを示しました。CRISPR / Cas9を介したcol14a1aノックアウト魚の分析は、コラーゲンXIV-Aがラミニンのタイムリーな沈着に寄与することを示しました。ECM組織の変化は組織の機械的特性に影響を与える可能性があるため、原子間力顕微鏡（AFM）を使用してcol14a1a（-/-）再生BMの生体力学を分析しました。私たちのデータは、コントロールと比較した場合、剛性の大幅な増加を伴うより薄いBMを明らかにしました。さらなるAFM3D再構成は、BMが、よりコンパクトな構造につながる変異体で妥協された、ソフト領域とリジッド領域の交互で作られたチェッカーボードとして編成されていることを示しました。コラーゲンXIV-Aは、おそらく再生BM内でのラミニンの統合を助けることにより、BM構造と生体力学に関与する分子スペーサーとして一時的に機能すると結論付けます。"]
[132,30733854,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","shank3a; shank3b","Molecular autism","Intestinal dysmotility in a zebrafish (Danio rerio) shank3a;shank3b mutant model  of autism.",2019,"10:3","[James DM et al.]","University of Miami, Coral Gables, FL, USA.",30733854,"10.1186/s13229-018-0250-4 ","Background and aims: Autism spectrum disorder (ASD) is currently estimated to affect more than 1% of the world population. For people with ASD, gastrointestinal (GI) distress is a commonly reported but a poorly understood co-occurring symptom. Here, we investigate the physiological basis for GI distress in ASD by studying gut function in a zebrafish model of Phelan-McDermid  syndrome (PMS), a condition caused by mutations in the SHANK3 gene. Methods: To generate a zebrafish model of PMS, we used CRISPR/Cas9 to introduce clinically related C-terminal frameshift mutations in shank3a and shank3b zebrafish paralogues (shank3abDeltaC). Because PMS is caused by SHANK3 haploinsufficiency,  we assessed the digestive tract (DT) structure and function in zebrafish shank3abDeltaC (+/-) heterozygotes. Human SHANK3 mRNA was then used to rescue DT  phenotypes in larval zebrafish. Results: Significantly slower rates of DT peristaltic contractions (p < 0.001) with correspondingly prolonged passage time  (p < 0.004) occurred in shank3abDeltaC (+/-) mutants. Rescue injections of mRNA encoding the longest human SHANK3 isoform into shank3abDeltaC (+/-) mutants produced larvae with intestinal bulb emptying similar to wild type (WT), but still deficits in posterior intestinal motility. Serotonin-positive enteroendocrine cells (EECs) were significantly reduced in both shank3abDeltaC (+/-) and shank3abDeltaC (-/-) mutants (p < 0.05) while enteric neuron counts and overall structure of the DT epithelium, including goblet cell number, were unaffected in shank3abDeltaC (+/-) larvae. Conclusions: Our data and rescue experiments support mutations in SHANK3 as causal for GI transit and motility abnormalities. Reductions in serotonin-positive EECs and serotonin-filled ENS boutons suggest an endocrine/neural component to this dysmotility. This is the first study to date demonstrating DT dysmotility in a zebrafish single gene mutant model of ASD.","fish","背景と目的：自閉症スペクトラム障害（ASD）は現在、世界人口の1％以上に影響を及ぼしていると推定されています。ASDの人の場合、胃腸（GI）の苦痛が一般的に報告されていますが、よく理解されていない同時発生の症状です。ここでは、SHANK3遺伝子の変異によって引き起こされる状態であるPhelan-McDermid症候群（PMS）のゼブラフィッシュモデルの腸機能を研究することにより、ASDにおけるGI苦痛の生理学的基礎を調査します。方法：PMSのゼブラフィッシュモデルを生成するために、CRISPR / Cas9を使用して、shank3aおよびshank3bゼブラフィッシュパラログ（shank3abDeltaC）に臨床的に関連するC末端フレームシフト変異を導入しました。PMSはSHANK3のハプロ不全によって引き起こされるため、ゼブラフィッシュのshank3abDeltaC（+/-）ヘテロ接合体の消化管（DT）の構造と機能を評価しました。次に、ヒトSHANK3 mRNAを使用して、ゼブラフィッシュ幼虫のDT表現型を救出しました。結果：shank3abDeltaC（+/-）変異体では、DT蠕動収縮の速度が大幅に低下し（p <0.001）、それに応じて通過時間が長くなりました（p <0.004）。最長のヒトSHANK3アイソフォームをコードするmRNAをshank3abDeltaC（+/-）変異体にレスキュー注射すると、野生型（WT）と同様に腸球が空になる幼虫が生まれましたが、それでも後部腸の運動性が不足しています。セロトニン陽性腸内分泌細胞（EEC）は、shank3abDeltaC（+/-）およびshank3abDeltaC（-/-）変異体の両方で有意に減少しました（p <0.05）が、腸管ニューロン数および杯細胞数を含むDT上皮の全体的な構造はshank3abDeltaC（+/-）幼虫では影響を受けません。結論：私たちのデータとレスキュー実験は、消化管通過と運動異常の原因として、SHANK3の変異をサポートしています。セロトニン陽性EECおよびセロトニン充填ENSブトンの減少は、この運動障害の内分泌/神経成分を示唆しています。これは、ASDのゼブラフィッシュ単一遺伝子変異体モデルにおけるDT運動障害を実証するこれまでの最初の研究です。"]
[133,30462579,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","erbb4a","Molecular biology of the cell","ErbB4 tyrosine kinase inhibition impairs neuromuscular development in zebrafish embryos.",2019,"30(2):209-218","[Paatero I et al.]","University of Turku, Turku, Finland.",30462579,"10.1091/mbc.E18-07-0460 ","Tyrosine kinase inhibitors are widely used in the clinic, but limited information is available about their toxicity in developing organisms. Here, we tested the effect of tyrosine kinase inhibitors targeting the ErbB receptors for their effects on developing zebrafish ( Danio rerio) embryos. Embryos treated with wide-spectrum pan-ErbB inhibitors or erbb4a-targeting antisense oligonucleotides  demonstrated reduced locomotion, reduced diameter of skeletal muscle fibers, and  reduced expression of muscle-specific genes, as well as reduced motoneuron length. The phenotypes in the skeletal muscle, as well as the defect in motility, were rescued both by microinjection of human ERBB4 mRNA and by transposon-mediated muscle-specific ERBB4 overexpression. The role of ErbB4 in regulating motility was further controlled by targeted mutation of the endogenous erbb4a locus in the zebrafish genome by CRISPR/Cas9. These observations demonstrate a potential for the ErbB tyrosine kinase inhibitors to induce neuromuscular toxicity in a developing organism via a mechanism involving inhibition of ErbB4 function.","fish","チロシンキナーゼ阻害剤は診療所で広く使用されていますが、発生中の生物におけるそれらの毒性については限られた情報しか入手できません。ここでは、ErbB受容体を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤の、ゼブラフィッシュ（Daniorerio）胚の発生に対する効果をテストしました。広域スペクトル汎ErbB阻害剤またはerbb4aターゲティングアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された胚は、運動ニューロンの長さの減少だけでなく、運動の減少、骨格筋線維の直径の減少、および筋肉特異的遺伝子の発現の減少を示した。骨格筋の表現型、および運動性の欠陥は、ヒトERBB4 mRNAのマイクロインジェクションと、トランスポゾンを介した筋肉特異的ERBB4過剰発現の両方によって救済されました。運動性の調節におけるErbB4の役割は、CRISPR / Cas9によるゼブラフィッシュゲノムの内因性erbb4a遺伝子座の標的変異によってさらに制御されました。これらの観察結果は、ErbBチロシンキナーゼ阻害剤がErbB4機能の阻害を含むメカニズムを介して発生中の生物に神経筋毒性を誘発する可能性を示しています。"]
[134,31218647,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","dj-1","Molecular neurobiology","Dysregulation in the Brain Protein Profile of Zebrafish Lacking the Parkinson's Disease-Related Protein DJ-1.",2019,"56(12):8306-8322","[Edson AJ et al.]","University of Bergen, Bergen, Norway.",31218647,"10.1007/s12035-019-01667-w ","DJ-1 is a protein with a wide range of functions importantly related to redox regulation in the cell. In humans, dysfunction of the PARK7 gene is associated with neurodegeneration and Parkinson's disease. Our objective was to establish a  novel DJ-1 knockout zebrafish line and to identify early brain proteome changes,  which could be linked to later pathology. The CRISPR-Cas9 method was used to target exon 1 of the park7-/- gene to produce a transgenic DJ-1-deficient zebrafish model of Parkinson's disease. Label-free mass spectrometry was employed to identify altered protein expression in the DJ-1 null brain of early adult animals. The park7(-/-) line appears to develop normally at young adult and larval stages. With aging however, DJ-1 null fish exhibit lower tyrosine hydroxylase levels, respiratory failure in skeletal muscle, and lower body mass which is especially prevalent among male fish. By proteomic analysis of early adult brains, we determined that less than 5% of the 4091 identified proteins were influenced by the lack of DJ-1. The dysregulated proteins were mainly proteins known to be involved in mitochondrial metabolism, mitophagy, stress response, redox regulation, and inflammation. This dysregulation in protein networks of our novel DJ-1-deficient zebrafish model occurs in the early adult stage preceding a Parkinson's disease-related phenotype and the reduction of tyrosine hydroxylase level. The identified protein changes provide new mechanistic background for DJ-1 function. The experimental power of zebrafish makes this model a highly valuable tool to understand and modulate cellular signaling leading to neurodegeneration.","fish","DJ-1は、細胞内のレドックス調節に重要な関連性を持つ幅広い機能を持つタンパク質です。ヒトでは、PARK7遺伝子の機能不全は神経変性とパーキンソン病に関連しています。私たちの目的は、新しいDJ-1ノックアウトゼブラフィッシュラインを確立し、後の病理にリンクされる可能性のある初期の脳プロテオームの変化を特定することでした。CRISPR-Cas9メソッドを使用してpark7-/-遺伝子のエキソン1をターゲットにし、パーキンソン病のトランスジェニックDJ-1欠損ゼブラフィッシュモデルを作成しました。ラベルフリー質量分析を使用して、初期成体動物のDJ-1ヌル脳におけるタンパク質発現の変化を特定しました。park7（-/-）ラインは、若年成人および幼虫の段階で正常に発達するように見えます。しかし、加齢に伴い、DJ-1ヌルフィッシュは、チロシンヒドロキシラーゼレベルの低下、骨格筋の呼吸障害、および特にオスの魚に多く見られる体重の低下を示します。初期の成人の脳のプロテオミクス分析により、4091個の同定されたタンパク質の5％未満がDJ-1の欠如によって影響を受けていると判断しました。調節不全のタンパク質は、主にミトコンドリアの代謝、マイトファジー、ストレス反応、酸化還元調節、および炎症に関与することが知られているタンパク質でした。私たちの新しいDJ-1欠損ゼブラフィッシュモデルのタンパク質ネットワークにおけるこの調節不全は、パーキンソン病に関連する表現型とチロシンヒドロキシラーゼレベルの低下に先行する成人初期段階で発生します。同定されたタンパク質の変化は、DJ-1機能の新しいメカニズムの背景を提供します。ゼブラフィッシュの実験力により、このモデルは、神経変性につながる細胞シグナル伝達を理解および調節するための非常に価値のあるツールになります。"]
[135,31380595,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","type-I vitellogenins (vtf1, 4, 5, 6, 7),  type-III vitellogenin (vtg3)","Molecular reproduction and development","Genome editing reveals reproductive and developmental dependencies on specific types of vitellogenin in zebrafish (Danio rerio).",2019,"86(9):1168-1188","[Yilmaz O  et al.]","INRA, UR1037, Rennes Cedex, France.",31380595,"10.1002/mrd.23231 ","Oviparous vertebrates produce multiple forms of vitellogenin (Vtg), the major source of yolk nutrients, but little is known about their individual contributions to reproduction and development. This study utilized clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) genome editing to assess essentiality and functionality of zebrafish (Danio rerio) type-I and type-III Vtgs. A multiple CRISPR approach was  employed to knockout (KO) all genes encoding type-I vtgs (vtg1, 4, 5, 6, and 7) simultaneously (vtg1-KO), and the type-III vtg (vtg3) individually (vtg3-KO). Results of polymerase chain reaction (PCR) genotyping and sequencing, quantitative PCR, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and Western blot analysis showed that only vtg6 and vtg7 escaped Cas9 editing. In fish whose  remaining type-I vtgs were incapacitated (vtg1-KO), and in vtg3-KO fish, significant increases in Vtg7 transcript and protein levels occurred in liver and eggs, revealing a heretofore-unknown mechanism of genetic compensation regulating Vtg homeostasis. Egg numbers per spawn were elevated more than 2-fold in vtg1-KO  females, and egg fertility was approximately halved in vtg3-KO females. Substantial mortality was evident in vtg3-KO eggs/embryos after only 8 hr of incubation and in vtg1-KO embryos after 5 days. Hatching rate and timing were markedly impaired in embryos from vtg mutant mothers and pericardial and yolk sac/abdominal edema and spinal lordosis were evident in the larvae, with feeding  and motor activities also being absent in vtg1-KO larvae. By late larval stages,  vtg mutations were either completely lethal (vtg1-KO) or nearly so (vtg3-KO). These novel findings offer the first experimental evidence that different types of vertebrate Vtg are essential and have disparate requisite functions at different times during both reproduction and development.","fish","卵生脊椎動物は、卵黄栄養素の主要な供給源であるビテロゲニン（Vtg）の複数の形態を生成しますが、生殖と発達への個々の貢献についてはほとんど知られていません。この研究では、クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）ゲノム編集を利用して、ゼブラフィッシュ（Daniorerio）のタイプIおよびタイプIIIVtgsの必須性と機能性を評価しました。複数のCRISPRアプローチを使用して、タイプI vtgs（vtg1、4、5、6、および7）を同時にエンコードするすべての遺伝子（vtg1-KO）とタイプIII vtg（vtg3）を個別にノックアウト（KO）しました（vtg3- KO）。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の遺伝子型決定と配列決定、定量的PCR、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析、およびウエスタンブロット分析の結果は、vtg6とvtg7のみがCas9編集を免れたことを示しました。残りのI型vtgsが無力化された魚（vtg1-KO）、およびvtg3-KO魚では、肝臓と卵でVtg7転写産物とタンパク質レベルの有意な増加が起こり、Vtgホメオスタシスを調節する遺伝的補償のこれまで知られていなかったメカニズムが明らかになりました。産卵あたりの卵数はvtg1-KO雌で2倍以上上昇し、卵受精率はvtg3-KO雌で約半分になりました。実質的な死亡率は、わずか8時間のインキュベーション後のvtg3-KO卵/胚、および5日後のvtg1-KO胚で明らかでした。vtg変異体の母親の胚では孵化率とタイミングが著しく損なわれ、幼虫では心膜および卵黄嚢/腹部浮腫と脊髄前弯症が明らかであり、vtg1-KO幼虫では摂食と運動活動も見られませんでした。幼虫期の後期までに、vtg変異は完全に致命的（vtg1-KO）またはほぼ致命的（vtg3-KO）のいずれかでした。これらの新しい発見は、異なるタイプの脊椎動物Vtgが必須であり、生殖と発達の両方の異なる時間に異なる必要な機能を持っているという最初の実験的証拠を提供します。"]
[136,30981829,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","miR-155","Neurobiology of disease","Ablation of the pro-inflammatory master regulator miR-155 does not mitigate neuroinflammation or neurodegeneration in a vertebrate model of Gaucher's disease.",2019,"127:563-569","[Watson L et al.]","University of Sheffield, Sheffield, UK.",30981829,"10.1016/j.nbd.2019.04.008 ","Bi-allelic mutations in the glucocerebrosidase gene (GBA1) cause Gaucher's disease, the most common human lysosomal storage disease. We previously reported  a marked increase in miR-155 transcript levels and early microglial activation in a zebrafish model of Gaucher's disease (gba1(-/-)). miR-155 is a master regulator of inflammation and has been implicated in a wide range of different neurodegenerative disorders. The observed miR-155 upregulation preceded the subsequent development of widespread pathology with marked neuroinflammation, closely resembling human Gaucher's disease pathology. We now report similar increases of miR-155 expression in mammalian models of GD, confirming that miR-155 upregulation is a shared feature in glucocerebrosidase (GCase) deficiency across different species. Using CRISPR/Cas9 mutagenesis we then generated a miR-155 mutant zebrafish line (miR-155(-/-)) with completely abolished miR-155 expression. Unexpectedly, loss of miR-155 did not mitigate either the reduced lifespan or the robust inflammatory phenotypes of gba1(-/-) mutant zebrafish. Our data demonstrate that neither neuroinflammation nor disease progression in GCase  deficiency are dependent on miR-155 and suggest that miR-155 inhibition would not be a promising therapeutic target in Gaucher's disease.","fish","グルコセレブロシダーゼ遺伝子（GBA1）の二対立遺伝子変異は、最も一般的なヒトリソソーム蓄積症であるゴーシェ病を引き起こします。以前、ゴーシェ病のゼブラフィッシュモデル（gba1（-/-））でmiR-155転写レベルの著しい増加と初期のミクログリア活性化を報告しました。miR-155は炎症のマスターレギュレーターであり、さまざまな神経変性疾患に関与しています。観察されたmiR-155のアップレギュレーションは、ヒトのゴーシェ病の病状に非常によく似た、顕著な神経炎症を伴う広範な病状のその後の発症に先行していました。GDの哺乳類モデルにおけるmiR-155発現の同様の増加を報告し、miR-155のアップレギュレーションが異なる種間でのグルコセレブロシダーゼ（GCase）欠損症の共通の特徴であることを確認しました。次に、CRISPR / Cas9変異誘発を使用して、miR-155の発現が完全に廃止されたmiR-155変異ゼブラフィッシュ系統（miR-155（-/-））を生成しました。予期せぬことに、miR-155の喪失は、gba1（-/-）変異ゼブラフィッシュの寿命の短縮または強力な炎症性表現型のいずれも軽減しませんでした。私たちのデータは、GCase欠損症における神経炎症も疾患の進行もmiR-155に依存していないことを示しており、miR-155阻害がゴーシェ病の有望な治療標的ではないことを示唆しています。"]
[137,30916346,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","gtpbp3","Nucleic acids research","Deletion of Gtpbp3 in zebrafish revealed the hypertrophic cardiomyopathy manifested by aberrant mitochondrial tRNA metabolism.",2019,"47(10):5341-5355","[Chen D et al.]","Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou, Zhejiang, China.",30916346,"10.1093/nar/gkz218 ","GTPBP3 is a highly conserved tRNA modifying enzyme for the biosynthesis of taum5U at the wobble position of mitochondrial tRNAGlu, tRNAGln, tRNALys, tRNATrp and tRNALeu(UUR). The previous investigations showed that GTPBP3 mutations were associated with hypertrophic cardiomyopathy (HCM). However, the pathophysiology of GTPBP3 deficiency remains elusively. Using the gtpbp3 knockout zebrafish generated by CRISPR/Cas9 system, we demonstrated the aberrant mitochondrial tRNA  metabolism in gtpbp3 knock-out zebrafish. The deletion of gtpbp3 may alter functional folding of tRNA, indicated by conformation changes and sensitivity to  S1-mediated digestion of tRNAGlu, tRNALys, tRNATrp and tRNALeu(UUR). Strikingly,  gtpbp3 knock-out zebrafish displayed the global increases in the aminoacylated efficiencies of mitochondrial tRNAs. The aberrant mitochondrial tRNA metabolisms  impaired mitochondrial translation, produced proteostasis stress and altered activities of respiratory chain complexes. These mitochondria dysfunctions caused the alterations in the embryonic heart development and reduced fractional shortening of ventricles in mutant zebrafish. Notably, the gtpbp3 knock-out zebrafish exhibited hypertrophy of cardiomyocytes and myocardial fiber disarray in ventricles. These cardiac defects in the gtpbp3 knock-out zebrafish recapitulated the clinical phenotypes in HCM patients carrying the GTPBP3 mutation(s). Our findings highlight the fundamental role of defective nucleotide  modifications of tRNAs in mitochondrial biogenesis and their pathological consequences in hypertrophic cardiomyopathy.","fish","GTPBP3は、ミトコンドリアのtRNAGlu、tRNAGln、tRNALys、tRNATrp、tRNALeu（UUR）のゆらぎ位置でtaum5Uを生合成するための高度に保存されたtRNA修飾酵素です。以前の調査では、GTPBP3変異が肥大性心筋症（HCM）と関連していることが示されました。ただし、GTPBP3欠損症の病態生理はとらえどころのないままです。CRISPR / Cas9システムによって生成されたgtbpp3ノックアウトゼブラフィッシュを使用して、gtbpp3ノックアウトゼブラフィッシュにおける異常なミトコンドリアtRNA代謝を実証しました。gtpbp3の削除は、コンフォメーションの変化と、tRNAGlu、tRNALys、tRNATrp、およびtRNALeu（UUR）のS1を介した消化に対する感度によって示される、tRNAの機能的折りたたみを変更する可能性があります。驚くべきことに、gtbpp3ノックアウトゼブラフィッシュは、ミトコンドリアtRNAのアミノアシル化効率の全体的な増加を示しました。異常なミトコンドリアtRNA代謝は、ミトコンドリアの翻訳を損ない、タンパク質恒常性ストレスを引き起こし、呼吸鎖複合体の活性を変化させました。これらのミトコンドリアの機能不全は、胚の心臓の発達に変化を引き起こし、変異ゼブラフィッシュの心室の短縮率を低下させました。特に、gtbpp3ノックアウトゼブラフィッシュは、心筋細胞の肥大と心室の心筋線維の乱れを示しました。gtpbp3ノックアウトゼブラフィッシュのこれらの心臓の欠陥は、GTPBP3変異を有するHCM患者の臨床表現型を再現しました。私たちの調査結果は、ミトコンドリアの生合成におけるtRNAの欠陥のあるヌクレオチド修飾の基本的な役割と肥大型心筋症におけるそれらの病理学的結果を強調しています。"]
[138,30892626,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas12a(Cpf1)"," ","Nucleic acids research","Enhanced Cas12a editing in mammalian cells and zebrafish.",2019,"47(8):4169-4180","[Liu P et al.]","University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, USA.",30892626,"10.1093/nar/gkz184 ","Type V CRISPR-Cas12a systems provide an alternate nuclease platform to Cas9, with potential advantages for specific genome editing applications. Here we describe improvements to the Cas12a system that facilitate efficient targeted mutagenesis  in mammalian cells and zebrafish embryos. We show that engineered variants of Cas12a with two different nuclear localization sequences (NLS) on the C terminus  provide increased editing efficiency in mammalian cells. Additionally, we find that pre-crRNAs comprising a full-length direct repeat (full-DR-crRNA) sequence with specific stem-loop G-C base substitutions exhibit increased editing efficiencies compared with the standard mature crRNA framework. Finally, we demonstrate in zebrafish embryos that the improved LbCas12a and FnoCas12a nucleases in combination with these modified crRNAs display high mutagenesis efficiencies and low toxicity when delivered as ribonucleoprotein complexes at high concentration. Together, these results define a set of enhanced Cas12a components with broad utility in vertebrate systems.","fish","タイプVCRISPR-Cas12aシステムは、Cas9の代替ヌクレアーゼプラットフォームを提供し、特定のゲノム編集アプリケーションに潜在的な利点をもたらします。ここでは、哺乳類細胞とゼブラフィッシュ胚の効率的な標的突然変異誘発を容易にするCas12aシステムの改善について説明します。C末端に2つの異なる核局在化配列（NLS）を持つCas12aの操作されたバリアントは、哺乳類細胞の編集効率を向上させることを示しています。さらに、特定のステムループGC塩基置換を伴う完全長ダイレクトリピート（full-DR-crRNA）配列を含むpre-crRNAは、標準の成熟crRNAフレームワークと比較して編集効率の向上を示すことがわかりました。最後に、ゼブラフィッシュ胚において、これらの修飾されたcrRNAと組み合わせた改良されたLbCas12aおよびFnoCas12aヌクレアーゼが、高濃度でリボヌクレオプロテイン複合体として送達された場合、高い突然変異誘発効率および低い毒性を示すことを示す。一緒に、これらの結果は、脊椎動物システムで幅広い有用性を持つ強化されたCas12aコンポーネントのセットを定義します。"]
[139,30643696,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","Histone deacetylase 4 (hdac4)","PeerJ","hdac4 mediates perichondral ossification and pharyngeal skeleton development in the zebrafish.",2019,"7:e6167","[DeLaurier A et al.]","University of South Carolina-Aiken, Aiken, SC, USA.",30643696,"10.7717/peerj.6167 ","Background: Histone deacetylases (HDACs) are epigenetic factors that function to  repress gene transcription by removing acetyl groups from the N-terminal of histone lysines. Histone deacetylase 4 (HDAC4), a class IIa HDAC, has previously  been shown to regulate the process of endochondral ossification in mice via repression of Myocyte enhancer factor 2c (MEF2C), a transcriptional activator of  Runx2, which in turn promotes chondrocyte maturation and production of bone by osteoblasts. Methods & Materials: In this study, we generated two zebrafish lines with mutations in hdac4 using CRISPR/Cas9 and analyzed mutants for skeletal phenotypes and expression of genes known to be affected by Hdac4 expression. Results: Lines have insertions causing a frameshift in a proximal exon of hdac4 and a premature stop codon. Mutations are predicted to result in aberrant protein sequence and a truncated protein, eliminating the Mef2c binding domain and Hdac domain. Zygotic mutants from two separate lines show a significant increase in ossification of pharyngeal ceratohyal cartilages at 7 days post fertilization (dpf) (p < 0.01, p < 0.001). At 4 dpf, mutant larvae have a significant increase  of expression of runx2a and runx2b in the ceratohyal cartilage (p < 0.05 and p <  0.01, respectively). A subset of maternal-zygotic (mz) mutant and heterozygote larvae (40%) have dramatically increased ossification at 7 dpf compared to zygotic mutants, including formation of a premature anguloarticular bone and mineralization of the first and second ceratobranchial cartilages and symplectic  cartilages, which normally does not occur until fish are approximately 10 or 12 dpf. Some maternal-zygotic mutants and heterozygotes show loss of pharyngeal first arch elements (25.9% and 10.2%, respectively) and neurocranium defects (30.8% and 15.2%, respectively). Analysis of RNA-seq mRNA transcript levels and in situ hybridizations from zygotic stages to 75-90% epiboly indicates that hdac4 is highly expressed in early embryos, but diminishes by late epiboly, becoming expressed again in larval stages. Discussion: Loss of function of hdac4 in zebrafish is associated with increased expression of runx2a and runx2b targets indicating that a role for hdac4 in zebrafish is to repress activation of ossification of cartilage. These findings are consistent with observations of precocious cartilage ossification in Hdac4 mutant mice, demonstrating that the function of Hdac4 in skeletal development is conserved among vertebrates. Expression of hdac4 mRNA in embryos younger than 256-512 cells indicates that there is a maternal contribution of hdac4 to the early embryo. The increase in ossification and profound loss of first pharyngeal arch elements and anterior neurocranium in a subset of maternal-zygotic mutant and heterozygote larvae suggests that maternal hdac4 functions in cartilage ossification and development  of cranial neural crest-derived structures.","fish","背景：ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）は、ヒストンリジンのN末端からアセチル基を除去することによって遺伝子転写を抑制するように機能するエピジェネティックな因子です。クラスIIaHDACであるヒストンデアセチラーゼ4（HDAC4）は、Runx2の転写活性化因子である筋細胞エンハンサー因子2c（MEF2C）の抑制を介して、マウスの軟骨内骨化のプロセスを調節し、軟骨細胞の成熟と産生を促進することが以前に示されています。骨芽細胞による骨の。方法と材料：この研究では、CRISPR / Cas9を使用してhdac4に変異がある2つのゼブラフィッシュ系統を生成し、Hdac4の発現によって影響を受けることが知られている遺伝子の骨格表現型と発現について変異体を分析しました。結果：ラインには、hdac4の近位エクソンと時期尚早の終止コドンにフレームシフトを引き起こす挿入があります。変異は、異常なタンパク質配列と短縮されたタンパク質をもたらし、Mef2c結合ドメインとHdacドメインを排除すると予測されています。2つの別々の系統からの接合変異体は、受精後7日（dpf）で咽頭ceratohyal軟骨の骨化の有意な増加を示します（p <0.01、p <0.001）。4 dpfで、変異幼虫はceratohyal軟骨におけるrunx2aとrunx2bの発現の有意な増加を示します（それぞれp <0.05とp <0.01）。母体接合（mz）変異体とヘテロ接合体幼虫のサブセット（40％）は、接合変異体と比較して7 dpfで骨化を劇的に増加させました。これには、未熟な角関節骨の形成や、第1および第2のceratobranchial軟骨とシンプレクティック軟骨の石灰化が含まれます。通常、魚が約10または12dpfになるまで発生しません。一部の母体接合変異体およびヘテロ接合体は、咽頭第一弓要素の喪失（それぞれ25.9％および10.2％）および脳頭蓋欠損（それぞれ30.8％および15.2％）を示します。RNA-seq mRNA転写レベルと接合期から75-90％エピボリーまでのinsituハイブリダイゼーションの分析は、hdac4が初期胚で高度に発現しているが、エピボリー後期までに減少し、幼虫期で再び発現するようになることを示しています。考察：ゼブラフィッシュにおけるhdac4の機能の喪失は、runx2aおよびrunx2bターゲットの発現の増加と関連しており、ゼブラフィッシュにおけるhdac4の役割は軟骨の骨化の活性化を抑制することであることを示しています。これらの発見は、Hdac4変異マウスにおける早熟な軟骨骨化の観察と一致しており、骨格発達におけるHdac4の機能が脊椎動物間で保存されていることを示しています。256-512細胞より若い胚におけるhdac4mRNAの発現は、初期胚へのhdac4の母体の寄与があることを示しています。母体接合変異体およびヘテロ接合体幼虫のサブセットにおける骨化の増加および最初の咽頭弓要素および前神経頭蓋の深刻な喪失は、母体hdac4が軟骨骨化および頭蓋神経紋由来構造の発達において機能することを示唆している。"]
[140,31251842,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","melanocortin 1 receptor (mc1r)","Pigment cell & melanoma research","Loss-of-function mutations in the melanocortin 1 receptor cause disruption of dorso-ventral countershading in teleost fish.",2019,"32(6):817-828","[Cal L et al.]","Institute of Marine  Research (IIM-CSIC), Vigo, Spain.",31251842,"10.1111/pcmr.12806 ","The melanocortin 1 receptor (MC1R) is the central melanocortin receptor involved  in vertebrate pigmentation. Mutations in this gene cause variations in coat coloration in amniotes. Additionally, in mammals MC1R is the main receptor for agouti-signaling protein (ASIP), making it the critical receptor for the establishment of dorsal-ventral countershading. In fish, Mc1r is also involved in pigmentation, but it has been almost exclusively studied in relation to melanosome dispersion activity and as a putative genetic factor involved in dark/light adaptation. However, its role as the crucial component for the Asip1-dependent control of dorsal-ventral pigmentation remains unexplored. Using  CRISPR/Cas9, we created mc1r homozygous knockout zebrafish and found that loss-of-function of mc1r causes a reduction of countershading and a general paling of the animals. We find ectopic development of melanophores and xanthophores, accompanied by a decrease in iridophore numbers in the ventral region of mc1r mutants. We also reveal subtle differences in the role of mc1r in  repressing pigment cell development between the skin and scale niches in ventral  regions.","fish","メラノコルチン1受容体（MC1R）は、脊椎動物の色素沈着に関与する中心的なメラノコルチン受容体です。この遺伝子の変異は、羊膜のコートの色に変化を引き起こします。さらに、哺乳類では、MC1Rはアグーチシグナル伝達タンパク質（ASIP）の主要な受容体であり、背腹のカウンターシェーディングを確立するための重要な受容体となっています。魚では、Mc1rも色素沈着に関与していますが、メラノソーム分散活性に関連して、暗/明適応に関与する推定遺伝的要因としてほぼ独占的に研究されています。ただし、背腹色素沈着のAsip1依存制御の重要なコンポーネントとしてのその役割は未踏のままです。CRISPR / Cas9を使用して、mc1rホモ接合型ノックアウトゼブラフィッシュを作成し、mc1rの機能喪失がカウンターシェーディングの減少と動物の一般的な痛みを引き起こすことを発見しました。mc1r変異体の腹側領域の虹彩胞数の減少を伴う、メラノフォアとキサントフォアの異所性発達を発見しました。また、腹側領域の皮膚と鱗のニッチの間の色素細胞の発達を抑制することにおけるmc1rの役割の微妙な違いを明らかにします。"]
[141,30970016,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","SWI/SNF-family chromatin remodeling protein atrx","PLoS genetics","Loss of atrx cooperates with p53-deficiency to promote the development of sarcomas and other malignancies.",2019,"15(4):e1008039","[Oppel F  et al.]","Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, USA.",30970016,"10.1371/journal.pgen.1008039 ","The SWI/SNF-family chromatin remodeling protein ATRX is a tumor suppressor in sarcomas, gliomas and other malignancies. Its loss of function facilitates the alternative lengthening of telomeres (ALT) pathway in tumor cells, while it also  affects Polycomb repressive complex 2 (PRC2) silencing of its target genes. To further define the role of inactivating ATRX mutations in carcinogenesis, we knocked out atrx in our previously reported p53/nf1-deficient zebrafish line that develops malignant peripheral nerve sheath tumors and gliomas. Complete inactivation of atrx using CRISPR/Cas9 was lethal in developing fish and resulted in an alpha-thalassemia-like phenotype including reduced alpha-globin expression. In p53/nf1-deficient zebrafish neither peripheral nerve sheath tumors nor gliomas showed accelerated onset in atrx+/- fish, but these fish developed various tumors that were not observed in their atrx+/+ siblings, including epithelioid sarcoma,  angiosarcoma, undifferentiated pleomorphic sarcoma and rare types of carcinoma. These cancer types are included in the AACR Genie database of human tumors associated with mutant ATRX, indicating that our zebrafish model reliably mimics  a role for ATRX-loss in the early pathogenesis of these human cancer types. RNA-seq of p53/nf1- and p53/nf1/atrx-deficient tumors revealed that down-regulation of telomerase accompanied ALT-mediated lengthening of the telomeres in atrx-mutant samples. Moreover, inactivating mutations in atrx disturbed PRC2-target gene silencing, indicating a connection between ATRX loss and PRC2 dysfunction in cancer development.","fish","SWI / SNFファミリーのクロマチンリモデリングタンパク質ATRXは、肉腫、神経膠腫、その他の悪性腫瘍の腫瘍抑制剤です。その機能の喪失は、腫瘍細胞におけるテロメア（ALT）経路の代替的な延長を促進する一方で、その標的遺伝子のポリコム抑制複合体2（PRC2）サイレンシングにも影響を及ぼします。発癌におけるATRX変異の不活性化の役割をさらに定義するために、悪性末梢神経鞘腫瘍および神経膠腫を発症する以前に報告されたp53 / nf1欠損ゼブラフィッシュ系統でatrxをノックアウトしました。CRISPR / Cas9を使用したatrxの完全な不活化は、魚の発育に致命的であり、アルファグロビン発現の低下を含むアルファサラセミアのような表現型をもたらしました。p53 / nf1欠損ゼブラフィッシュでは、末梢神経鞘腫瘍も神経膠腫もatrx +/-魚の発症の加速を示さなかったが、これらの魚は、類上皮肉腫、血管肉腫、未分化多形性肉腫など、atrx + / +兄弟では観察されなかったさまざまな腫瘍を発症した。まれな種類の癌腫。これらの癌タイプは、変異型ATRXに関連するヒト腫瘍のAACR Genieデータベースに含まれており、ゼブラフィッシュモデルがこれらのヒト癌タイプの初期の病因におけるATRX喪失の役割を確実に模倣していることを示しています。p53 / nf1-およびp53 / nf1 / atrx欠損腫瘍のRNA-seqは、テロメラーゼのダウンレギュレーションが、atrx変異体サンプルにおけるテロメアのALTを介した延長を伴うことを明らかにしました。さらに、atrxの不活性化変異は、PRC2標的遺伝子のサイレンシングを妨害し、ATRXの喪失と癌の発生におけるPRC2の機能不全との関連を示しています。"]
[142,31048868,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","glycine receptor alpha subunits (glra1, glra2, glra3, glra4a, glra4b)","PloS one","Individual knock out of glycine receptor alpha subunits identifies a specific requirement of glra1 for motor function in zebrafish.",2019,"14(5):e0216159","[Samarut E  et al.]","Universite de Montreal, Montreal, QC, Canada.",31048868,"10.1371/journal.pone.0216159 ","Glycine receptors (GlyRs) are ligand-gated chloride channels mediating inhibitory neurotransmission in the brain stem and spinal cord. They function as pentamers composed of alpha and beta subunits for which 5 genes have been identified in human (GLRA1, GLRA2, GLRA3, GLRA4, GLRB). Several in vitro studies showed that the pentameric subtype composition as well as its stoichiometry influence the distribution and the molecular function of the receptor. Moreover, mutations in some of these genes are involved in different human conditions ranging from tinnitus to epilepsy and hyperekplexia, suggesting distinct functions of the different subunits. Although the beta subunit is essential for synaptic clustering of the receptor, the specific role of each alpha subtype is still puzzling in vivo. The zebrafish genome encodes for five glycine receptor alpha subunits (glra1, glra2, glra3, glra4a, glra4b) thus offering a model of choice to investigate the respective role of each subtype on general motor behaviour. After establishing a phylogeny of GlyR subunit evolution between human and zebrafish, we checked the temporal expression pattern of these transcripts during embryo development. Interestingly, we found that glra1 is the only maternally transmitted alpha subunit. We also showed that the expression of the different GlyR subunits starts at different time points during development. Lastly, in order to decipher the role of each alpha subunit on the general motor behaviour of the fish, we knocked out individually each alpha subunit by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis. Surprisingly, we found that knocking out any of the alpha2, 3, a4a or a4b subunit did not lead to any obvious developmental or motor phenotype. However, glra1-/- (hitch) embryos depicted a strong motor dysfunction from 3 days, making them incapable to swim and thus leading to their  premature death. Our results infer a strong functional redundancy between alpha subunits and confirm the central role played by glra1 for proper inhibitory neurotransmission controlling locomotion. The genetic tools we developed here will be of general interest for further studies aiming at dissecting the role of  GlyRs in glycinergic transmission in vivo and the hitch mutant (hic) is of specific relevance as a new model of hyperekplexia.","fish","グリシン受容体（GlyR）は、脳幹と脊髄における抑制性神経伝達を媒介するリガンド依存性クロライドチャネルです。それらは、ヒトで5つの遺伝子が同定されているアルファおよびベータサブユニット（GLRA1、GLRA2、GLRA3、GLRA4、GLRB）で構成される五量体として機能します。いくつかのinvitro研究は、五量体サブタイプの組成とその化学量論が受容体の分布と分子機能に影響を与えることを示しました。さらに、これらの遺伝子のいくつかの変異は、耳鳴りからてんかんおよびびっくり病に至るまでのさまざまな人間の状態に関与しており、さまざまなサブユニットの異なる機能を示唆しています。ベータサブユニットは受容体のシナプスクラスタリングに不可欠ですが、各アルファサブタイプの特定の役割は依然としてinvivoで不可解です。ゼブラフィッシュのゲノムは、5つのグリシン受容体アルファサブユニット（glra1、glra2、glra3、glra4a、glra4b）をエンコードするため、一般的な運動行動における各サブタイプのそれぞれの役割を調査するための最適なモデルを提供します。ヒトとゼブラフィッシュの間のGlyRサブユニット進化の系統発生を確立した後、胚発生中のこれらの転写産物の時間的発現パターンを確認しました。興味深いことに、glra1が唯一の母性感染アルファサブユニットであることがわかりました。また、さまざまなGlyRサブユニットの発現が、発生中のさまざまな時点で開始することも示しました。最後に、魚の一般的な運動行動における各アルファサブユニットの役割を解読するために、CRISPR / Cas9を標的とした突然変異誘発によって各アルファサブユニットを個別にノックアウトしました。驚いたことに、alpha2、3、a4a、またはa4bサブユニットのいずれかをノックアウトしても、明らかな発達または運動の表現型が得られないことがわかりました。しかし、glra1-/-（ヒッチ）胚は3日目から強い運動機能障害を示し、泳ぐことができなくなり、早死に至りました。私たちの結果は、アルファサブユニット間の強力な機能的冗長性を推測し、運動を制御する適切な抑制性神経伝達のためにglra1が果たす中心的な役割を確認します。ここで開発した遺伝的ツールは、in vivoでのグリシン作動性伝達におけるGlyRの役割を分析することを目的としたさらなる研究にとって一般的に興味深いものであり、ヒッチ変異体（hic）は高エクプレキシアの新しいモデルとして特に関連性があります。"]
[143,30615627,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;"," ","PloS one","Deep learning image recognition enables efficient genome editing in zebrafish by  automated injections.",2019,"14(1):e0202377","[Cordero-Maldonado ML  et al.]","University of Luxembourg, Belvaux, Luxembourg.",30615627,"10.1371/journal.pone.0202377 ","One of the most popular techniques in zebrafish research is microinjection. This  is a rapid and efficient way to genetically manipulate early developing embryos,  and to introduce microbes, chemical compounds, nanoparticles or tracers at larval stages. Here we demonstrate the development of a machine learning software that allows for microinjection at a trained target site in zebrafish eggs at unprecedented speed. The software is based on the open-source deep-learning library Inception v3. In a first step, the software distinguishes wells containing embryos at one-cell stage from wells to be skipped with an accuracy of 93%. A second step was developed to pinpoint the injection site. Deep learning allows to predict this location on average within 42 mum to manually annotated sites. Using a Graphics Processing Unit (GPU), both steps together take less than 100 milliseconds. We first tested our system by injecting a morpholino into the middle of the yolk and found that the automated injection efficiency is as efficient as manual injection (~ 80%). Next, we tested both CRISPR/Cas9 and DNA construct injections into the zygote and obtained a comparable efficiency to that of an experienced experimentalist. Combined with a higher throughput, this results in a higher yield. Hence, the automated injection of CRISPR/Cas9 will allow high-throughput applications to knock out and knock in relevant genes to study their mechanisms or pathways of interest in diverse areas of biomedical research.","fish","ゼブラフィッシュの研究で最も人気のある技術の1つは、マイクロインジェクションです。これは、初期の発達中の胚を遺伝的に操作し、幼虫期に微生物、化学的化合物、ナノ粒子、またはトレーサーを導入するための迅速かつ効率的な方法です。ここでは、前例のない速度でゼブラフィッシュの卵の訓練された標的部位でのマイクロインジェクションを可能にする機械学習ソフトウェアの開発を示します。このソフトウェアは、オープンソースの深層学習ライブラリInceptionv3に基づいています。最初のステップでは、ソフトウェアは、1細胞期の胚を含むウェルとスキップされるウェルを93％の精度で区別します。注射部位を特定するために、2番目のステップが開発されました。深い学習により、手動で注釈が付けられたサイトまで、平均42mum以内でこの場所を予測できます。グラフィックスプロセッシングユニット（GPU）を使用すると、両方のステップを合わせて100ミリ秒未満で完了します。最初に卵黄の真ん中にモルホリノを注入することによってシステムをテストし、自動注入効率が手動注入と同じくらい効率的であることを発見しました（〜80％）。次に、ザイゴートへのCRISPR / Cas9とDNAコンストラクトの両方の注入をテストし、経験豊富な実験家と同等の効率を得ました。より高いスループットと組み合わせると、より高い歩留まりが得られます。したがって、CRISPR / Cas9の自動注入により、高スループットのアプリケーションが関連する遺伝子をノックアウトおよびノックインして、生物医学研究のさまざまな分野で関心のあるメカニズムまたは経路を研究できるようになります。"]
[144,31822609,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","il7","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","Evolutionary transition from degenerate to nonredundant cytokine signaling networks supporting intrathymic T cell development.",2019,null,"[Lawir DF et al.]","Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics, Freiburg, Germany.",31822609,"10.1073/pnas.1915223116 ","In mammals, T cell development critically depends on the IL-7 cytokine signaling  pathway. Here we describe the identification of the zebrafish ortholog of mammalian IL-7 based on chromosomal localization, deduced protein sequence, and expression patterns. To examine the biological role of il7 in teleosts, we generated an il7 allele lacking most of its coding exons using CRISPR/Cas9-based  mutagenesis. il7-deficient animals are viable and exhibit no obvious signs of immune disorder. With respect to intrathymic T cell development, il7 deficiency is associated with only a mild reduction of thymocyte numbers, contrasting with a more pronounced impairment of T cell development in il7r-deficient fish. Genetic  interaction studies between il7 and il7r mutants, and il7 and crlf2(tslpr) mutants suggest the contribution of additional, as-yet unidentified cytokines to  intrathymic T cell development. Such activities were also ascertained for other cytokines, such as il2 and il15, collectively indicating that in contrast to the  situation in mammals, T cell development in the thymus of teleosts is driven by a degenerate multicomponent network of gammac cytokines; this explains why deficiencies of single components have little detrimental effect. In contrast, the dependence on a single cytokine in the mammalian thymus has catastrophic consequences in cases of congenital deficiencies in genes affecting the IL-7 signaling pathway. We speculate that the transition from a degenerate to a nonredundant cytokine network supporting intrathymic T cell development emerged as a consequence of repurposing evolutionarily ancient constitutive cytokine pathways for regulatory functions in the mammalian peripheral immune system.","fish","哺乳類では、T細胞の発達はIL-7サイトカインシグナル伝達経路に決定的に依存しています。ここでは、染色体の局在、推定されるタンパク質配列、および発現パターンに基づいた、哺乳類IL-7のゼブラフィッシュオルソログの同定について説明します。硬骨魚類におけるil7の生物学的役割を調べるために、CRISPR / Cas9ベースの突然変異誘発を使用して、コーディングエクソンのほとんどを欠くil7対立遺伝子を生成しました。il7欠損動物は生存能力があり、免疫障害の明らかな兆候は見られません。胸腺内T細胞の発達に関して、il7欠損は、胸腺細胞数の軽度の減少にのみ関連しており、il7r欠損魚におけるT細胞発達のより顕著な障害とは対照的です。il7とil7rの変異体、およびil7とcrlf2（tslpr）の変異体の間の遺伝的相互作用の研究は、胸腺内T細胞の発達に対する追加のまだ同定されていないサイトカインの寄与を示唆しています。このような活動は、il2やil15などの他のサイトカインについても確認されており、哺乳類の状況とは対照的に、テレオストの胸腺におけるT細胞の発達はガンマcサイトカインの縮重多成分ネットワークによって駆動されることをまとめて示しています。これは、単一のコンポーネントの欠陥がほとんど悪影響を及ぼさない理由を説明しています。対照的に、哺乳類の胸腺における単一のサイトカインへの依存は、IL-7シグナル伝達経路に影響を与える遺伝子の先天性欠損症の場合に壊滅的な結果をもたらします。胸腺内T細胞の発達をサポートする縮退したサイトカインネットワークから非冗長なサイトカインネットワークへの移行は、哺乳類の末梢免疫系における調節機能のために進化的に古代の構成的サイトカイン経路を転用した結果として現れたと推測します。"]
[145,30765521,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","sine oculis homeobox 6b; sine oculis homeobox 7","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","Six6 and Six7 coordinately regulate expression of middle-wavelength opsins in zebrafish.",2019,"116(10):4651-4660","[Ogawa Y et al.]","University of Tokyo, Tokyo, Japan.",30765521,"10.1073/pnas.1812884116 ","Color discrimination in the vertebrate retina is mediated by a combination of spectrally distinct cone photoreceptors, each expressing one of multiple cone opsins. The opsin genes diverged early in vertebrate evolution into four classes  maximally sensitive to varying wavelengths of light: UV (SWS1), blue (SWS2), green (RH2), and red (LWS) opsins. Although the tetrachromatic cone system is retained in most nonmammalian vertebrate lineages, the transcriptional mechanism  underlying gene expression of the cone opsins remains elusive, particularly for SWS2 and RH2 opsins, both of which have been lost in the mammalian lineage. In zebrafish, which have all four cone subtypes, rh2 opsin gene expression depends on a homeobox transcription factor, sine oculis homeobox 7 (Six7). However, the six7 gene is found only in the ray-finned fish lineage, suggesting the existence  of another evolutionarily conserved transcriptional factor(s) controlling rh2 opsin expression in vertebrates. Here, we found that the reduced rh2 expression caused by six7 deficiency was rescued by forced expression of six6b, which is a six7-related transcription factor conserved widely among vertebrates. The compensatory role of six6b was reinforced by ChIP-sequencing analysis, which revealed a similar pattern of Six6b- and Six7-binding sites within and near the cone opsin genes. TAL effector nuclease-induced genetic ablation of six6b and six7 revealed that they coordinately regulate SWS2 opsin gene expression. Mutant  larvae deficient for these transcription factors showed severely impaired visually driven foraging behavior. These results demonstrate that in zebrafish, six6b and six7 govern expression of the SWS2 and RH2 opsins responsible for middle-wavelength sensitivity, which would be physiologically important for daylight vision.","fish","脊椎動物の網膜の色の識別は、それぞれが複数の錐体オプシンの1つを発現するスペクトル的に異なる錐体光受容体の組み合わせによって媒介されます。オプシン遺伝子は、脊椎動物の進化の初期に、さまざまな波長の光に最大に敏感な4つのクラス、UV（SWS1）、青（SWS2）、緑（RH2）、および赤（LWS）オプシンに分岐しました。四色錐体システムはほとんどの非哺乳類脊椎動物系統で保持されていますが、錐体オプシンの遺伝子発現の根底にある転写メカニズムは、特に哺乳類系統で失われているSWS2およびRH2オプシンについてはとらえどころのないままです。4つのコーンサブタイプすべてを持つゼブラフィッシュでは、rh2オプシン遺伝子の発現はホメオボックス転写因子であるsine oculisホメオボックス7（Six7）に依存します。ただし、six7遺伝子は光線で覆われた魚の系統にのみ見られ、脊椎動物のrh2オプシン発現を制御する別の進化的に保存された転写因子の存在を示唆しています。ここでは、six7欠損によって引き起こされたrh2発現の低下が、脊椎動物の間で広く保存されているsix7関連転写因子であるsix6bの強制発現によって救済されたことを発見しました。six6bの代償的役割は、ChIPシーケンス分析によって強化され、コーンオプシン遺伝子内およびその近くのSix6bおよびSix7結合部位の同様のパターンが明らかになりました。TALエフェクターヌクレアーゼによるsix6bおよびsix7の遺伝子除去により、SWS2オプシン遺伝子の発現が協調的に調節されていることが明らかになりました。これらの転写因子を欠損した変異幼虫は、視覚的に駆動される採餌行動に深刻な障害を示しました。これらの結果は、ゼブラフィッシュでは、six6bとsix7が、日光の視力にとって生理学的に重要な中波長感度の原因となるSWS2およびRH2オプシンの発現を支配していることを示しています。"]
[146,31792362,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","lin28b","Scientific reports","LIN28B affects gene expression at the hypothalamic-pituitary axis and serum testosterone levels.",2019,"9(1):18060","[Leinonen JT et al.]","University of Helsinki, Helsinki, Finland.",31792362,"10.1038/s41598-019-54475-6 ","Genome-wide association studies (GWAS) have recurrently associated sequence variation nearby LIN28B with pubertal timing, growth and disease. However, the biology linking LIN28B with these traits is still poorly understood. With our study, we sought to elucidate the mechanisms behind the LIN28B associations, with a special focus on studying LIN28B function at the hypothalamic-pituitary (HP) axis that is ultimately responsible for pubertal onset. Using CRISPR-Cas9 technology, we first generated lin28b knockout (KO) zebrafish. Compared to controls, the lin28b KO fish showed both accelerated growth tempo, reduced adult  size and increased expression of mitochondrial genes during larval development. Importantly, data from the knockout zebrafish models and adult humans imply that  LIN28B expression has potential to affect gene expression in the HP axis. Specifically, our results suggest that LIN28B expression correlates positively with the expression of ESR1 in the hypothalamus and POMC in the pituitary. Moreover, we show how the pubertal timing advancing allele (T) for rs7759938 at the LIN28B locus associates with higher testosterone levels in the UK Biobank data. Overall, we provide novel evidence that LIN28B contributes to the regulation of sex hormone pathways, which might help explain why the gene associates with several distinct traits.","fish","ゲノムワイドアソシエーション研究（GWAS）は、LIN28Bの近くの配列変化を、思春期のタイミング、成長、および疾患と繰り返し関連付けています。ただし、LIN28Bとこれらの特性をリンクする生物学はまだよくわかっていません。私たちの研究では、思春期の発症に最終的に関与する視床下部-下垂体（HP）軸でのLIN28B機能の研究に特に焦点を当てて、LIN28B関連の背後にあるメカニズムを解明しようとしました。CRISPR-Cas9テクノロジーを使用して、最初にlin28bノックアウト（KO）ゼブラフィッシュを生成しました。コントロールと比較して、lin28b KO魚は、成長テンポの加速、成魚のサイズの減少、および幼生の発育中のミトコンドリア遺伝子の発現の増加の両方を示しました。重要なことに、ノックアウトゼブラフィッシュモデルと成人のデータからのデータは、LIN28Bの発現がHP軸の遺伝子発現に影響を与える可能性があることを示唆しています。具体的には、我々の結果は、LIN28Bの発現が視床下部のESR1および下垂体のPOMCの発現と正の相関があることを示唆している。さらに、LIN28B遺伝子座でのrs7759938の思春期のタイミング進行アレル（T）が、UKBiobankデータのより高いテストステロンレベルとどのように関連するかを示します。全体として、LIN28Bが性ホルモン経路の調節に寄与するという新しい証拠を提供します。これは、遺伝子がいくつかの異なる形質と関連する理由を説明するのに役立つ可能性があります。"]
[147,31527654,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","fibronectin domain containing protein 3a (fndc3a)","Scientific reports","ECM alterations in Fndc3a (Fibronectin Domain Containing Protein 3A) deficient zebrafish cause temporal fin development and regeneration defects.",2019,"9(1):13383","[Liedtke D  et al.]","Julius-Maximilians-University, Wurzburg, Germany.",31527654,"10.1038/s41598-019-50055-w ","Fin development and regeneration are complex biological processes that are highly relevant in teleost fish. They share genetic factors, signaling pathways and cellular properties to coordinate formation of regularly shaped extremities. Especially correct tissue structure defined by extracellular matrix (ECM) formation is essential. Gene expression and protein localization studies demonstrated expression of fndc3a (fibronectin domain containing protein 3a) in both developing and regenerating caudal fins of zebrafish (Danio rerio). We established a hypomorphic fndc3a mutant line (fndc3a(wue1/wue1)) via CRISPR/Cas9, exhibiting phenotypic malformations and changed gene expression patterns during early stages of median fin fold development. These developmental effects are mostly temporary, but result in a fraction of adults with permanent tail fin deformations. In addition, caudal fin regeneration in adult fndc3a(wue1/wue1) mutants is hampered by interference with actinotrichia formation and epidermal cell organization. Investigation of the ECM implies that loss of epidermal tissue structure is a common cause for both of the observed defects. Our results thereby provide a molecular link between these developmental processes and foreshadow Fndc3a as a novel temporal regulator of epidermal cell properties during extremity development and regeneration in zebrafish.","fish","ヒレの発達と再生は、硬骨魚に非常に関連する複雑な生物学的プロセスです。それらは、遺伝的要因、シグナル伝達経路、および細胞特性を共有して、規則的な形状の四肢の形成を調整します。特に細胞外マトリックス（ECM）形成によって定義される正しい組織構造が不可欠です。遺伝子発現とタンパク質局在の研究は、ゼブラフィッシュ（Daniorerio）の尾びれの発達と再生の両方でfndc3a（タンパク質3aを含むフィブロネクチンドメイン）の発現を示しました。CRISPR / Cas9を介して低形態のfndc3a変異株（fndc3a（wue1 / wue1））を確立し、表現型の奇形を示し、フィンフォールドの中央値の発達の初期段階で遺伝子発現パターンを変化させました。これらの発達上の影響はほとんど一時的なものですが、永続的な尾びれの変形を伴う成人の一部をもたらします。さらに、成体fndc3a（wue1 / wue1）変異体の尾鰭再生は、放線菌形成と表皮細胞組織への干渉によって妨げられます。ECMの調査は、表皮組織構造の喪失が、観察された両方の欠陥の一般的な原因であることを示唆しています。それにより、我々の結果は、これらの発達過程と、ゼブラフィッシュの四肢の発達および再生中の表皮細胞特性の新しい時間的調節因子としての伏線Fndc3aとの間の分子リンクを提供します。"]
[148,31337771,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","androgen receptor","Scientific reports","Liver-specific androgen receptor knockout attenuates early liver tumor development in zebrafish.",2019,"9(1):10645","[Li H et al.]","National University of Singapore, Singapore, Singapore.",31337771,"10.1038/s41598-019-46378-3 ","Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most severe cancer types and many genetic and environmental factors contribute to the development of HCC. Androgen  receptor (AR) signaling is increasingly recognized as one of the important factors associated with HCC. Previously, we have developed an inducible HCC model in kras transgenic zebrafish. In the present study, to investigate the role of AR in liver tumor development, we specifically knocked out ar gene in the liver of zebrafish via the CRISPR/Cas9 system and the knockout zebrafish was named L-ARKO  for liver-specific ar knockout. We observed that liver-specific knockout of ar attenuated liver tumor development in kras transgenic zebrafish at the early stage (one week of tumor induction). However, at the late stage (two weeks of tumor induction), essentially all kras transgenic fish continue to develop HCC irrespective of the absence or presence of ar gene, indicating an overwhelming role of the driver oncogene kras over ar knockout. Consistently, cell proliferation was reduced at the early stage, but not the late stage, of liver tumor induction in the kras/L-ARKO fish, indicating that the attenuant effect of  ar knockout was at least in part via cell proliferation. Furthermore, androgen treatment showed acceleration of HCC progression in kras fish but not in kras/L-ARKO fish, further indicating the abolishment of ar signalling. Therefore, we have established a tissue-specific ar knockout zebrafish and it should be a valuable tool to investigate AR signalling in the liver in future.","fish","肝細胞癌（HCC）は、最も重症の癌の種類の1つであり、多くの遺伝的および環境的要因がHCCの発症に寄与しています。アンドロゲン受容体（AR）シグナル伝達は、HCCに関連する重要な要因の1つとしてますます認識されています。以前、krasトランスジェニックゼブラフィッシュで誘導性HCCモデルを開発しました。本研究では、肝臓腫瘍の発生におけるARの役割を調査するために、CRISPR / Cas9システムを介してゼブラフィッシュの肝臓のar遺伝子を特異的にノックアウトし、ノックアウトゼブラフィッシュを肝臓特異的arノックアウトのL-ARKOと名付けました。我々は、arの肝臓特異的ノックアウトが初期段階（腫瘍誘導の1週間）でkrasトランスジェニックゼブラフィッシュの肝腫瘍発生を弱めることを観察した。しかし、後期（腫瘍誘発の2週間）では、本質的にすべてのkrasトランスジェニック魚はar遺伝子の有無に関係なく、HCCを発症し続け、arノックアウトに対するドライバー腫瘍遺伝子krasの圧倒的な役割を示しています。一貫して、細胞増殖はkras / L-ARKO魚の肝腫瘍誘発の初期段階で減少しましたが、後期段階では減少しませんでした。これは、arノックアウトの減衰効果が少なくとも部分的に細胞増殖を介したことを示しています。さらに、アンドロゲン処理は、kras / L-ARKO魚ではなく、kras魚でHCC進行の加速を示し、arシグナル伝達の廃止をさらに示しています。したがって、組織固有のarノックアウトゼブラフィッシュを確立しました。これは、将来、肝臓でのARシグナル伝達を調査するための貴重なツールになるはずです。"]
[149,30867490,"animal\n(fish)","zebrafish","TALENs;","Polycomb Repressive Complex 2 catalytic subunit (ezh1)","Scientific reports","Ezh1 arises from Ezh2 gene duplication but its function is not required for zebrafish development.",2019,"9(1):4319","[Volkel P et al.]","Inserm U908, Lille, France.",30867490,"10.1038/s41598-019-40738-9 ","Trimethylation on H3K27 mediated by Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) is required to control gene repression programs involved in development, regulation  of tissue homeostasis or maintenance and lineage specification of stem cells. In  Drosophila, the PRC2 catalytic subunit is the single protein E(z), while in mammals this function is fulfilled by two proteins, Ezh1 and Ezh2. Based on database searches, we propose that Ezh1 arose from an Ezh2 gene duplication that  has occurred in the common ancestor to elasmobranchs and bony vertebrates. Expression studies in zebrafish using in situ hybridization and RT-PCR followed by the sequencing of the amplicon revealed that ezh1 mRNAs are maternally deposited. Then, ezh1 transcripts are ubiquitously distributed in the entire embryo at 24 hpf and become more restricted to anterior part of the embryo at later developmental stages. To unveil the function of ezh1 in zebrafish, a mutant line was generated using the TALEN technology. Ezh1-deficient mutant fish are viable and fertile, but the loss of ezh1 function is responsible for the earlier  death of ezh2 mutant larvae indicating that ezh1 contributes to zebrafish development in absence of zygotic ezh2 gene function. Furthermore, we show that presence of ezh1 transcripts from the maternal origin accounts for the delayed lethality of ezh2-deficient larvae.","fish","Polycomb Repressive Complex 2（PRC2）によって媒介されるH3K27のトリメチル化は、幹細胞の発生、組織恒常性の調節、または維持と系統の特定に関与する遺伝子抑制プログラムを制御するために必要です。ドロソフィラでは、PRC2触媒サブユニットは単一のタンパク質E（z）ですが、哺乳類では、この機能は2つのタンパク質、Ezh1とEzh2によって果たされます。データベース検索に基づいて、Ezh1は、板鰓綱および骨性脊椎動物の共通の祖先で発生したEzh2遺伝子重複から生じたと提案します。insituハイブリダイゼーションとRT-PCRを使用したゼブラフィッシュでの発現研究とそれに続くアンプリコンの配列決定により、ezh1mRNAが母性的に沈着していることが明らかになりました。次に、ezh1転写産物は、24 hpfで胚全体に遍在的に分布し、後の発達段階で胚の前部にさらに制限されます。ゼブラフィッシュにおけるezh1の機能を明らかにするために、TALENテクノロジーを使用して変異株を作成しました。Ezh1欠損変異魚は生存可能で繁殖力がありますが、ezh1機能の喪失はezh2変異幼生の早期死亡の原因であり、ezh1が接合性ezh2遺伝子機能の欠如下でゼブラフィッシュの発達に寄与することを示しています。さらに、母性起源からのezh1転写産物の存在が、ezh2欠損幼虫の致死性の遅延を説明していることを示します。"]
[150,30700796,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","interlectin 3","Scientific reports","Intelectin 3 is dispensable for resistance against a mycobacterial infection in zebrafish (Danio rerio).",2019,"9(1):995","[Ojanen MJT et al.]","University of Tampere, Tampere, Finland.",30700796,"10.1038/s41598-018-37678-1 ","Tuberculosis is a multifactorial bacterial disease, which can be modeled in the zebrafish (Danio rerio). Abdominal cavity infection with Mycobacterium marinum, a close relative of Mycobacterium tuberculosis, leads to a granulomatous disease in adult zebrafish, which replicates the different phases of human tuberculosis, including primary infection, latency and spontaneous reactivation. Here, we have  carried out a transcriptional analysis of zebrafish challenged with low-dose of M. marinum, and identified intelectin 3 (itln3) among the highly up-regulated genes. In order to clarify the in vivo significance of Itln3 in immunity, we created nonsense itln3 mutant zebrafish by CRISPR/Cas9 mutagenesis and analyzed the outcome of M. marinum infection in both zebrafish embryos and adult fish. The lack of functional itln3 did not affect survival or the mycobacterial burden in the zebrafish. Furthermore, embryonic survival was not affected when another mycobacterial challenge responsive intelectin, itln1, was silenced using morpholinos either in the WT or itln3 mutant fish. In addition, M. marinum infection in dexamethasone-treated adult zebrafish, which have lowered lymphocyte counts, resulted in similar bacterial burden in both WT fish and homozygous itln3 mutants. Collectively, although itln3 expression is induced upon M. marinum infection in zebrafish, it is dispensable for protective mycobacterial immune response.","fish","結核は多因子性細菌性疾患であり、ゼブラフィッシュ（Daniorerio）でモデル化できます。Mycobacteriumtuberculosisの近縁種であるMycobacteriummarinumによる腹部腔感染は、成体ゼブラフィッシュに肉芽腫性疾患を引き起こし、一次感染、潜伏期、自発的再活性化など、ヒト結核のさまざまな段階を再現します。ここでは、低用量のM. marinumでチャレンジされたゼブラフィッシュの転写分析を実施し、高度にアップレギュレートされた遺伝子の中からインテレクチン3（itln3）を同定しました。免疫におけるItln3のinvivoでの重要性を明らかにするために、CRISPR / Cas9変異誘発によってナンセンスitln3変異ゼブラフィッシュを作成し、ゼブラフィッシュ胚と成魚の両方でM.marinum感染の結果を分析しました。機能的なitln3の欠如は、ゼブラフィッシュの生存やマイコバクテリアの負担に影響を与えませんでした。さらに、別のマイコバクテリアチャレンジ応答性インテレクチンであるitln1が、WTまたはitln3変異魚のいずれかでモルホリノを使用してサイレンシングされた場合、胚の生存は影響を受けませんでした。さらに、リンパ球数を減少させたデキサメタゾン処理成体ゼブラフィッシュにおけるM. marinum感染は、WT魚とホモ接合型itln3変異体の両方で同様の細菌負荷をもたらしました。まとめると、itln3の発現はゼブラフィッシュのM. marinum感染時に誘導されますが、マイコバクテリアの免疫応答を保護するためには不可欠です。"]
[151,30411440,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","kif15","Traffic","Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9-mediated  kif15 mutations accelerate axonal outgrowth during neuronal development and regeneration in zebrafish.",2019,"20(1):71-81","[Dong Z et al.]","Nantong University, Nantong, China.",30411440,"10.1111/tra.12621 ","KIF15, the vertebrate kinesin-12, is best known as a mitotic motor protein, but continues to be expressed in neurons. Like KIF11 (the vertebrate kinesin-5), KIF15 interacts with microtubules in the axon to limit their sliding relative to  one another. Unlike KIF11, KIF15 also regulates interactions between microtubules and actin filaments at sites of axonal branch formation and in growth cones. Our  original work on these motors was done on cultured rat neurons, but we are now using zebrafish to extend these studies to an in vivo model. We previously studied kif15 in zebrafish by injecting splice-blocking morpholinos injected into embryos. Consistent with the cell culture work, these studies demonstrated that axons grow faster and longer when KIF15 levels are reduced. In the present study, we applied CRISPR/Cas9-based knockout technology to create kif15 mutants and labeled neurons with Tg(mnx1:GFP) transgene or transient expression of elavl3:EGFP-alpha tubulin. We then compared by live imaging the homozygotic, heterozygotic mutants to their wildtype siblings to ascertain the effects of depletion of kif15 during Caudal primary motor neuron and Rohon-Beard (R-B) sensory neuron development. The results showed, compared to the kif15 wildtype, the number of branches was reduced while axon outgrowth was accelerated in kif15  homozygotic and heterozygotic mutants. In R-B sensory neurons, after laser irradiation, injured axons with loss of kif15 displayed significantly greater regenerative velocity. Given these results and the fact that kif15 drugs are currently under development, we posit kif15 as a novel target for therapeutically augmenting regeneration of injured axons.","fish","脊椎動物のキネシン-12であるKIF15は、有糸分裂モータータンパク質として最もよく知られていますが、ニューロンで発現し続けています。KIF11（脊椎動物のキネシン-5）と同様に、KIF15は軸索内の微小管と相互作用して、相互のスライドを制限します。KIF11とは異なり、KIF15は、軸枝形成部位および成長円錐内の微小管とアクチンフィラメント間の相互作用も調節します。これらのモーターに関する私たちの最初の作業は、培養ラットニューロンで行われましたが、現在、ゼブラフィッシュを使用してこれらの研究をinvivoモデルに拡張しています。我々は以前、胚に注入されたスプライスブロッキングモルホリノを注入することにより、ゼブラフィッシュでkif15を研究しました。細胞培養の研究と一致して、これらの研究は、KIF15レベルが低下すると軸索がより速くそしてより長く成長することを示しました。本研究では、CRISPR / Cas9ベースのノックアウト技術を適用して、kif15変異体を作成し、Tg（mnx1：GFP）導入遺伝子またはelavl3：EGFP-alphaチューブリンの一過性発現でニューロンを標識しました。次に、ホモ接合性、ヘテロ接合性の変異体を野生型の兄弟とライブイメージングして比較し、尾側一次運動ニューロンおよびRohon-Beard（RB）感覚ニューロンの発達中のkif15の枯渇の影響を確認しました。結果は、kif15野生型と比較して、軸索伸長がkif15ホモ接合性およびヘテロ接合性変異体で加速される一方で、枝の数が減少したことを示した。RB感覚ニューロンでは、レーザー照射後、kif15の喪失を伴う損傷した軸索は、有意に高い再生速度を示しました。これらの結果とkif15薬が現在開発中であるという事実を考慮して、我々はkif15を損傷した軸索の再生を治療的に増強するための新しい標的として位置づけます。"]
[152,30684501,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;","foxc1b","Vision research","Loss of foxc1 in zebrafish reduces optic nerve size and cell number in the retinal ganglion cell layer.",2019,"156:66-72","[Umali J et al.]","Memorial University of Newfoundland, Canada.",30684501,"10.1016/j.visres.2019.01.008 ","Mutation of FOXC1 causes Axenfeld-Rieger Syndrome (ARS) with early onset or congenital glaucoma. We assessed retinal ganglion cell (RGC) number in zebrafish  due to CRISPR-mediated mutation and antisense inhibition of two-forkhead box transcription factors, foxc1a and foxc1b. These genes represent duplicated homologues of human FOXC1. Using a CRISPR induced null mutation in foxc1b, in combination with antisense inhibition of foxc1a, we demonstrate reduced cell number in the retinal ganglion cell layer of developing zebrafish eyes. As early  as 5days post fertilization (dpf), fewer RGCs are found in foxc1b homozygous mutants injected with foxc1a morpholinos, and a thinner optic nerve results. Our  data illustrates that foxc1 is required for the expression of atonal homolog 7 (atoh7), a gene that is necessary for RGC differentiation. As markers of differentiated RGCs (pou4f2) are downregulated in foxc1b-/- mutants injected with foxc1a morpholinos and no cell death is observed, our results are consistent with defects in the differentiation of RGCs leading to reduced cell number, as opposed to increased cell death of RGCs or off targets effects of morpholino injection. Our zebrafish model demonstrates that aberrant regulation of RGC number could act in concert with other known glaucoma risk factors to influence the development of congenital and early onset glaucoma due to FOXC1 mutation.","fish","FOXC1の変異は、早期発症型または先天性緑内障を伴うAxenfeld-Rieger症候群（ARS）を引き起こします。CRISPRを介した変異と2フォークヘッドボックス転写因子foxc1aとfoxc1bのアンチセンス阻害によるゼブラフィッシュの網膜神経節細胞（RGC）数を評価しました。これらの遺伝子は、ヒトFOXC1の重複した相同体を表しています。foxc1aのアンチセンス阻害と組み合わせてfoxc1bのCRISPR誘導ヌル変異を使用して、発達中のゼブラフィッシュの眼の網膜神経節細胞層における細胞数の減少を示します。受精後5日（dpf）には、foxc1aモルホリノを注射したfoxc1bホモ接合変異体で見られるRGCが少なくなり、視神経が薄くなります。私たちのデータは、フォックスc1がRGC分化に必要な遺伝子であるアトナールホモログ7（atoh7）の発現に必要であることを示しています。分化したRGCのマーカー（pou4f2）は、foxc1a morpholinosを注入したfoxc1b-/-変異体でダウンレギュレートされ、細胞死は観察されないため、我々の結果は、細胞死の増加とは対照的に、細胞数の減少につながるRGCの分化の欠陥と一致しています。モルホリノ注射のRGCまたはオフターゲット効果の。私たちのゼブラフィッシュモデルは、RGC数の異常な調節が他の既知の緑内障の危険因子と協調して作用し、FOXC1変異による先天性および早期発症の緑内障の発症に影響を与える可能性があることを示しています。"]
[153,30585775,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR/Cas9"," ","Zebrafish","Fluorescently Labeled TracrRNA Improves Work Flow and Facilitates Successful Genome Editing in Zebrafish.",2019,"16(1):135-137","[Hamimi M et al.]","Monash University, Clayton, Australia.",30585775,"10.1089/zeb.2018.1669 ","Gene editing using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is widely used throughout the zebrafish community for the generation of  knockouts and knockins. One of the bottlenecks that exists during the process is  the laborious screening of injected embryos for F0 founder fish or CRISPants, weeks after the injection date. In this study we show that the use of fluorescently tagged tracrRNA and sorting for fluorescent embryos as early as the 512-cell stage using stereomicroscope significantly improve yield of fish with successfully CRISPR/Cas9-edited genomes. This is a cost-effective strategy that significantly improves workflow and efficacy in genome editing in particular for  less experienced researchers.","fish","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）を使用した遺伝子編集は、ノックアウトとノックインの生成のためにゼブラフィッシュコミュニティ全体で広く使用されています。プロセス中に存在するボトルネックの1つは、注入日から数週間後に、F0ファウンダーフィッシュまたはCRISPantsの注入された胚の面倒なスクリーニングです。この研究では、蛍光タグ付きtracrRNAを使用し、実体顕微鏡を使用して512細胞期の早い段階で蛍光胚を選別することにより、CRISPR / Cas9で編集されたゲノムで魚の収量が大幅に向上することを示しています。これは費用効果の高い戦略であり、特に経験の浅い研究者にとって、ゲノム編集のワークフローと有効性を大幅に向上させます。"]
[154,31645484,"animal\n(fish)","zebrafish","CRISPR;Cas9;","KIAA0196","Zhong nan da xue xue bao. Yi xue ban = Journal of Central South University. Medical sciences","[Establishment and preliminary mechanism study of the zebrafish strain of KIAA0196: A candidate pathogenic gene for heart development].",2019,"44(9):968-975","[Bu H et al.]","Central South University, Changsha, China.",31645484,"10.11817/j.issn.1672-7347.2019.180360 ","OBJECTIVE: To explore the effects of KIAA0196 gene on cardiac development and the establishment of zebrafish strain. Methods: Peripheral blood and gDNA from patients were extracted. Copy number variation analysis and target sequencing were conducted to screen candidate genes. The KIAA0196 knockout zebra fi sh was generated by CRISPR/Cas9 to detect whether KIAA0196 de fi ciency could affect cardiac development. Finally, the wild-type and mutant zebrafish were anatomized  and histologically stained to observe the phenotype of heart defects. Results: The KIAA0196 knockout zebrafish strain was successfully constructed using CRISPR/Cas9 technology. After 60 hours fertilization, microscopic examination of  KIAA0196 knockout zebrafish (heterozygote + homozygote) showed pericardial effusion, cardiac compression and severely curly tail. Compared with wild-type zebrafish, the hearts of mutant KIAA0196 zebra fi sh had cardiac defects including smaller atrium and larger ventricle, and the myocardial cells were looser. Conclusion: KIAA0196 gene plays an important regulatory role in the development of heart. It might be a candidate gene for congenital heart disease.","fish","目的：心臓の発達とゼブラフィッシュ株の確立に対するKIAA0196遺伝子の影響を調査すること。方法：患者から末梢血とgDNAを抽出した。候補遺伝子をスクリーニングするために、コピー数変動分析と標的配列決定を行った。KIAA0196ノックアウトゼブラフィッシュは、KIAA0196の欠損が心臓の発達に影響を与える可能性があるかどうかを検出するために、CRISPR / Cas9によって生成されました。最後に、野生型および変異型ゼブラフィッシュを解剖し、組織学的に染色して、心臓の欠陥の表現型を観察しました。結果：KIAA0196ノックアウトゼブラフィッシュ株は、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して正常に構築されました。60時間の施肥後、KIAA0196ノックアウトゼブラフィッシュ（ヘテロ接合体+ホモ接合体）の顕微鏡検査は、心膜滲出液、心臓圧迫、および重度の巻き毛の尾を示しました。野生型ゼブラフィッシュと比較して、変異体KIAA0196ゼブラフィッシュの心臓は、より小さな心房とより大きな心室を含む心臓の欠陥があり、心筋細胞はより緩いものでした。結論：KIAA0196遺伝子は、心臓の発達において重要な調節的役割を果たしています。先天性心疾患の候補遺伝子かもしれません。"]